CNV在植物研究中的案例分析2

发稿时间：2016-04-22来源：天昊生物

英文题目：Copy Number Variation of Cytokinin Oxidase Gene Tackx4 Associated with Grain Weight and Chlorophyll Content of Flag Leaf in Common Wheat
期刊名：PLOS ONE
发表日期: 2015年12月
研究背景：
       光合作用对食品和纤维生产是至关重要的，约70–90%的粮食生产来源于灌浆期的光合作用产物。在高等植物叶片中，叶绿素是叶绿体的主要光合色素，它的含量直接影响植物光合作用效率，从而影响作物产量。因此了解叶绿素生物合成和控制叶绿素含量的遗传机制对改善作物产量至关重要。研究表明植物激素细胞分裂素（CTK）能够显著增加叶片叶绿素含量，叶绿体稳定性和净光合速率。异戊烯基转移酶基因（IPT）过表达转基因植株通常表现出持续绿色的表型，这是因为其体内的细胞分裂素（CTK）含量很高。细胞分裂素氧化酶（CKX）可以使细胞分裂素水平不可逆失活，因此细胞分裂素氧化酶可通过调控细胞分裂素含量来调控叶绿素含量和光合作用，因此细胞分裂素氧化酶基因被认为与叶绿素水平和稳定性有紧密关系。目前很多研究关注细胞分裂素氧化酶基因与作物产量及其相关性状的关系。在小麦中，7个Tackx基因被分离出来，包括染色体3A上的Tackx1；7A或7B上的Tackx2；3DS上的Tackx2.1 和Tackx2.2；3DS上的Tackx3，Tackx5和Tackx6；这些Tackx基因通常与小麦穗粒重或穗粒数相关，然而目前对于Tackx基因与叶绿素水平的关系还不清楚。因此本文想解决两个问题： （1）鉴定Tackx基因变异形式以及它们与粒重和叶绿素水平的关系； （2）验证Tackx基因对粒重和叶绿素水平的影响。
研究材料： 169株京411 ×红芒春21的小麦重组自交系；102株小麦自然群体
研究性状：小麦粒重；小麦开花5, 10, 15, 20, 25 天后旗叶叶绿素的含量
技术平台： PCR
研究思路：

•        测量亲本，重组自交系群体，自然群体的粒重和叶绿素水平；
•        开花后不同时期叶绿素含量和粒重的关联性分析；
•        所有Tackx基因与叶绿素含量，粒重的关联性分析；
•        设计所有Tackx基因的引物用来检测其变异形式；
•        Tackx4基因变异形式与叶绿素含量及粒重的关联性分析；
•        使用中国春小麦缺体四体系把Tackx4定位到染色体上；
•        控制叶绿素含量和粒重的QTL定位；
•        Tackx4基因变异形式和叶绿素含量，粒重的连锁分析；
•        Tackx4基因三个拷贝的序列分析；

研究结果：
测量粒重和叶绿素水平
       以169株京411 ×红芒春21的小麦重组自交系为研究对象，其中京411四季的平均千粒重是46.2 g，而红芒春21的平均千粒重是20.9 g。这两个亲本在产量，旗叶叶绿素含量和粒重方面具有明显的差异，102株的小麦自然群体在旗叶叶绿素含量和粒重方面也有明显的差异（Table 1）。 叶绿素含量和粒重的关联性
       小麦重组自交系群体内旗叶叶绿素含量和粒重表现出较大的波动（Table 1）。开花后不同时期的叶绿素含量和粒重关联性分析表明在小麦灌浆前期旗叶叶绿素含量对于粒重有明显影响。
Tackx基因与叶绿素含量，粒重的关联性
       关联性分析发现在所有Tackx基因中Tackx4基因与旗叶叶绿素含量和粒重有明显的关联性（Table 2）。接着设计所有已分离Tackx基因的引物用来检测它们的变异形式，结果在重组自交系群体中检测到Tackx4基因有两种表达模式：京411的基因型A和红芒春211的基因型B（Fig 1），Tackx4基因的两个片段表现出共分离。分析表明开花5-15天后携带基因型A个体的叶绿素含量和粒重要比携带基因型B个体的高（Table 2），这些结果说明基因型A与叶绿素含量和粒重显著关联。
Table 2. 重组自交系群体内Tackx4基因的两种基因型与旗叶叶绿素含量和粒重关联性分析 Tackx4基因的染色体定位
       以前的研究表明细胞分裂素氧化酶基因CKX属于一个大的基因家族，主要分布在染色体3A, 3B, 3D, 7A, 7B上，本文使用中国春小麦缺体四体系把Tackx4定位到染色体上。使用引物T19-20在中国春小麦上检测到两个扩增片段Tackx4-2和Tackx4-3（Fig 2）, 被定义为基因型C。而从N3AT3B, N3AT3D和山羊草（DD基因组） 中则不能扩增出Tackx4基因 （Fig 2），说明Tackx4基因在普通小麦的3A染色体上。这些结果也表明使用Tackx4基因引物T19-20至少能从普通小麦中扩增出3个片段。 Tackx4和基因特异标记的连锁分析
       为了分析Tackx4在染色体3A上的遗传连锁并进一步评价它对叶绿素含量和粒重表型变异的作用，挑选了染色体3A上的49个SSR markers用来区分两个亲本（京411 和红芒春21）以及两个池（20个高得分RIL个体和20个低得分RIL个体）。49个SSR markers中，有13个SSR markers和T19-20都展现出多态性，并且位于同一个连锁群（Fig 3）。结果鉴定到一个同时控制开花5-15天旗叶叶绿素含量和粒重的基因座位，位于染色体3A markers T19-20和wmc169之间 （Fig 3）。比对到Tackx4基因上的QTL可以解释叶绿素含量和粒重8.9%-22.3%的变化（Table 3）。
  Tackx4变异形式和叶绿素含量，粒重的连锁分析
       为了进一步确定Tackx4不同变异形式对叶绿素含量，粒重的作用效果，对小麦自然群体（102种）进行了基因型鉴定，并分析了Tackx4基因型与粒重之间的关系。在这102个小麦品种中，有49种携带基因型A，15种携带基因型B，38种携带基因型C（Fig 4）。基因型和性状的连锁分析表明叶绿素含量（C5, C10, C15），粒重与基因型A呈正相关，但是与基因型B和C 呈负相关（Table 4）。 Tackx4 三个拷贝的序列分析
       对Tackx4-1, Tackx4-2, Tackx4-3 进行测序分析。这3个片段与Tackx4（BM138354）（在本次研究中用于设计引物T19-20）有超过99%的同源性，并且片段相互之间也超过98%的同源（Figs 5, 6）。这些结果表明Tackx4（BM138354）实际上是这3个片段中的一个。Tackx4 三个拷贝的序列差异主要位于262bp -378bp的内含子区域，它有明显的内含子-外显子边界序列“GT/AG”。在这个内含子中发现了2个8-bp的插入和一个“AAA-TTT”变异，另外在外显子区域发现了数个SNP位点（Figs 5）。