一问一答一世界：了解微生物扩增子测序

发稿时间：2016-07-19来源：天昊生物

Q1:哪些样品可以进行微生物多样性检测？

A:根据微生态的类型不同，扩增子测序检测的样品可以分为以下类型

Q2:扩增子测序目前可以分为哪几种类型？

A:目前扩增子测序服务主要包括细菌16S rDNA区/真菌ITS1区/真菌ITS2区/真菌18S rDNA区/功能微生物的功能基因测序，具体类型如下：

16S rDNA测序： 16S rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因，存在于所有细菌基因组。16S rDNA大小适中，约1.5Kb左右， 16S rDNA具有10个保守区和9个高变区 (V1-V9)， 其中保守区在细菌间差异不大， 高变区具有高度的特异性，因此可以通过对某个或某些高变区进行测序，从而对细菌菌落结构多样性进行分析。

18S rDNA测序：18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和高变区，保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异，18S rDNA在进化速率上相对于ITS更加保守，一般在用于种以上的物种分类。

ITS 测序：在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA转录间隔序列称为ITS区。ITS分为两个区域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。ITS由于是非转录区，承受的选择压力较小，变异强，目前已广泛用于种及种以下真菌分类鉴定。

功能微生物的功能基因测序：功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到广泛关注的一类微生物，如硝化细菌、反硝化菌、氨氧化细菌、硫酸盐还原菌、固氮菌、固氮菌等。每种功能微生物在分类学上可能有很大不同，但却具有相类似的基因使其能够发挥同样的功能，因此使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。功能基因测序就是针对这些功能基因设计PCR通用引物，进行建库高通量测序。

Q3:扩增子测序区段如何选择？

A: 由于选择不同的高变区，相同菌群的分类结果差别明显，因此需根据文献找到与您研究的微环境以及与您比较关注的菌群所用的区段，如果目前对其中菌群不是十分了解的话那么也尽量选择类似环境，需要详细查找文献。

Q4: 扩增子测序是否需要设置生物学重复，如果需要多少合适？

A: 为了保证实验结果的准确性，而且根据现已发表的文章，扩增子测序都需要设置生物学重复。如果是环境样本建议最少3个生物学重复，例如某一地点的土壤样品需要采集3份另外，实验组和对照组的样本重复数量和实验条件需保持一致；如果是宿主样本建议最少20个个体，例如粪便样本，口咽样本，唾液样本都至少来自20个个体。

Q5: 收集样本时为什么需要收集相关样本信息？

A: 因为扩增子测序研究目的核心包括三方面的内容：研究样品中的物种分类、物种丰度以及揭示环境因子和微生物群落结构之间的关系，因此收集样本时有必要收集样品的信息，例如医学：性别、年龄、BMI、体重、是否服用抗生素、饮食习惯、疾病史、种族、地域等指标。农业和环境：光照、温度、湿度、离子浓度、PH、磷、有机碳、有机氮等指标。

Q6: 肠道微生物研究取样有什么注意问题？

A: 假设您要对人体肠道微生物菌群进行测序，一般建议采取新鲜样品，这是因为微生物本身是活的，样品长期保存会改变原有菌群的构成；另外一般用无菌勺子取粪便中间，这是因为外层会与肠粘膜接触，有人体脱落细胞污染；另外先排尿，避免尿液污染；另外如果寄送的是样品而不是DNA，采样后务必立即封存样品冷冻保存，切忌反复冻融，送样时使用干冰运输，尽量缩短保存和运输的时间，谨防污染，尽可能地保持样品中微生物的原始结构。

Q7:肠道微生物研究对象的筛选标准是什么？

A: 举个鉴定与结直肠癌发生发展相关的肠道核心菌群的例子。

研究对象是：28份位置匹配的活检标本，其中包括正常肠道组织样本，腺瘤性息肉组织样本，肿瘤组织样本。

研究对象的筛选标准是：

正常组：所有志愿者无特殊饮食习惯；年龄在20-60岁之间；志愿者的健康状况由自我报告和结肠镜检查来判断；志愿者均无胃肠道疾病史，无肝、胆、膜腺等消化系统疾病史；无手术史而且在样本采集3个月前没有服用抗生素。

病例组：志愿者要接受问卷调查，调查内容包括年龄、性别、遗传、饮食、药物治疗情况等。要求性别比例均衡；年龄阶段尽可能一致，没有吸烟、饮食不均衡等不良习惯；标本收集前3个月没有使用过各种抗生素或益生菌；没有２年以上醜酒史；不具有代谢性疾病，如肥胖症、糖尿病、结石、各种肝病等；不具有家族聚集性疾病。

Q8:皮肤微生物研究对象的筛选标准是什么？

A: 举个鉴定皮肤表皮不同部位真菌差异的例子。

研究对象：十位健康成年人身上收集了容易发生真菌性皮肤病的十四个皮肤部位拭子样本。研究对象的筛选标准是：排除包括慢性皮肤疾病的对象；前6个月不使用抗菌药物；洗澡可以被允许，但是仅能使用非抗菌肥皂或清洁剂；收集样本24小时前没有洗澡。

Q9:口腔微生物研究对象的筛选标准是什么？

A: 举个鉴定牙周炎患者不同口腔环境的微生物群落组成的例子。

研究对象：牙周炎患者和健康志愿者的唾液，牙龈上菌斑，牙龈下菌斑样本。

研究对象的筛选标准是：患者在样本收集前的3个月内没有接受牙周治疗；所有参与者没有怀孕或任何系统性疾病；在过去的3个月内没有抗生素治疗；至少20个牙齿在口腔内。所有参与者在采样3小时前不要吃喝。

Q10:现在是个环境样本就能进行微生物多样性研究，但是怎么在前期实验对象组合设计上更有新意？

A: 较早微生物多样性研究的实验对象组合只是简单的病例/对照样本，现在实验对象组合上已经向复杂的方向发展，通过下面的表格就一目了然了。

微生物多样性与健康

微生物多样性与环境

 

微生物多样性与农业