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The ISME Journal：氮循环微生物群落丰度与组成的关系揭示了土壤pH值对橡树衰退的间接影响

发稿时间：2020-11-30来源：天昊生物

英文题目: Relationships between nitrogen cycling microbial community abundance and composition reveal the indirect effect of soil pH on oak decline

中文题目：氮循环微生物群落丰度与组成的关系揭示了土壤pH值对橡树衰退的间接影响

期刊名： The ISME Journal

影响因子：9.18

发表时间：2020年10月

树木衰退是一个全球性的问题，其主要原因往往是未知的。氮波动与酸化化合物之间的复杂相互作用被认为是导致栎树养分失衡和胁迫耐受性降低的因素。微生物是调节植物土壤氮有效性的关键，但对土壤氮循环与树木健康的关系知之甚少。在这里，我们将关键硝化和反硝化基因的高通量测序和qPCR分析和土壤化学分析相结合来描述与症状（衰退）和无症状（明显健康）橡树（Quercus robur和 Q. petraea）有关的土壤中氨氧化细菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）和反硝化群落的特征。无症状树的AOB丰度与土壤pH呈正相关，AOA丰度与树木健康之间没有关系。然而，AOA的丰度是由较低的NH₄⁺浓度驱动的，这进一步支持AOA有利于降低土壤NH₄⁺浓度的观点。反硝化细菌的丰度主要受土壤C:N及其与AOB的相关性影响，无论树木是否健康。这些结果表明，通过平衡C:N来改善土壤酸化，可能会影响AOB丰度，驱动N的转化，减轻对衰退栎树的胁迫。

树木健康是一个全球关注的问题，因为它们提供了基本的生态系统，但由于病虫害爆发或环境变化，大量森林正在消失。在温带地区，橡树衰退和死亡率增加。一些生物因子和非生物胁迫源被认为是导致橡树衰退的因素，包括温度升高、污染、侵入性害虫和病原体。由于这些胁迫源与因子之间存在复杂的相互作用，识别和改善导致衰退症状的土壤胁迫源是橡树健康管理的一个挑战。在英国和欧洲，许多橡树正在经历氮（N）沉积和酸化化合物的增加，这被认为是破坏养分循环和降低胁迫耐受性的因素。在氮限制系统中，增加土壤氮以促进植物生长，增加树木对昆虫和植物病原菌损害的敏感性，从而改变昆虫活动和昆虫种群密度，降低树木的抗冻性。相比之下，缺氮的土壤可能会抑制植物生长，导致植物生长较弱、生长缓慢，更容易受到昆虫和病原体的侵袭。因此，很难弄清土壤氮有效性对树木健康的直接和间接影响，很大程度上是由于植物病虫害、植物生理、根系小气候和土壤微生物群落的混杂影响。微生物在土壤氮循环和调节植物可利用氮方面起着关键作用。两个关键过程（即硝化和反硝化）在这方面尤为重要。自养硝化的关键过程和速率限制步骤包括铵（NH₄⁺）氧化为亚硝酸盐（NO₂⁻），由氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）驱动。亚硝酸盐随后被氧化成硝酸盐（NO₃⁻），通过淋滤和/或反硝化作用，导致生态系统中的氮净损失。虽然AOA和AOB共存于土壤中，但它们对土壤环境因子的响应不同，AOB和AOA之间存在生态位分化。例如，AOA在酸性土壤中的占主导优势，以及AOA而不是AOB有利于低铵环境，如未施肥土壤。此外，研究还发现了植物对AOA和AOB群落丰度的调节作用，即在植物冠层下发现了更高的AOB丰度，这可能是由于植物凋落物增加导致的较高氮浓度。微生物利用有机碳和氮的变化也会改变土壤微生物群落的整体结构，进而影响硝化作用。为了确定土壤氮循环的不稳定是否与橡树的胁迫和衰退有关，需要更好地了解控制介导这些氮转化过程的土壤微生物的丰度和多样性的机制。在这项研究中，我们描述了英国七个林地中驱动土壤氮转化的微生物群落的丰度和多样性，这些微生物群落与有症状和无症状的橡树（Quercus robur和Q. petraea）有关。采用分段结构方程模型，分析了土壤非生物环境对与栎树健康相关的氮循环微生物群落的直接和间接影响。我们假设有症状和无症状的树木之间，氮循环微生物群落的结构和丰度会有所不同，这是由于土壤化学性质的内在差异可能会影响微生物的组成和功能。

样本地点和策略：

这项研究是在英格兰的七个以橡树为主的阔叶林地上进行的，那里既有衰退的橡树（有症状的）也有没有衰退的（无症状的）树木（图1）。根据树冠的表型状况，以及是否存在与急性衰退相关的茎部病变，或是否存在与根腐真菌（Armillaria sp.或者 Gymnopus fusipes）相关的茎部病变，在每个地点选择了10棵有症状和10棵无症状树。

使用Cranfield大学2020年《土壤指南》确定了每个地点的主要土壤类别: Attingham，Bigwood，Great Monks Wood，Langdale和Speculation被识别为地表水潜育层，Chestnuts Wood 和 Winding Wood被识别为棕色土壤。不同地点的橡树密度各不相同，从Chestnuts wood的214.29棵橡树/公顷到Langdale的30.95棵橡树/公顷不等。所研究橡树的平均基础面积在整个站点之间也有所不同，从Attingham的32.55 m²/ 公顷到Bigwood的11.55 m²/ 公顷。土壤样本取自土壤剖面顶部0-20 cm处，从距每棵树底部2m处均匀分布的三个土芯中提取。在所有取样点，降雨发生在取样前一天或取样期间。在七个研究地点共收集了420个土样。将土壤在4°C的冰上放置5h，然后在-20°C下存储。

土壤化学分析与硝化潜力：

分析土壤水分含量和化学性质。通过在105°C下烘箱干燥24小时或直到达到恒重，来分析土壤含水量。使用C:N元素分析仪测量总C和N浓度。在水悬浮液中测定土壤pH值(土壤：水比为1：2.5）。使用1M KCl从新鲜的土壤中提取有效的土壤硝酸盐（NO₃⁻）和铵（NH₄⁺），并通过色度计分析进行测量。用添加了NH₄⁺（0.3 mM NH₄Cl）的摇动土壤泥浆来测量土壤硝化电位。使用Dionex ICS-3000测量NH₄⁺的浓度。通过对NH₄⁺浓度随时间进行线性回归分析来确定NH₄⁺去除率。

氮循环基因的qPCR和扩增子测序：

使用以下引物进行对基因丰度进行qPCR定量分析：古菌氨单加氧酶（amoA）基因的(CrenamoA-23F / CrenamoA-616R)和细菌氨单加氧酶（amoA）基因的(amoa-1F/amoA-2R)，nirS（亚硝酸盐还原酶）基因的（nirsS-Cd3aF/nirS-R3cd），nirK（亚硝酸盐还原酶）基因的（nirK-1F / nirK-5R）和nosZ（一氧化二氮还原酶）基因的（nosz2F / nosz2R）。同时使用以下引物进行扩增子测序：细菌16S rRNA的（Bakt 341F/Bakt 805R）；古菌16S rRNA的（344F/915R）；以及amoA AOB、amoA AOA、nirS和nosZ氮循环功能基因（如上所列）。

土壤化学特性和硝化潜力

七个地点之间和内部的土壤高度异质。在整个站点中，pH值范围从在Winding Wood的酸性较高的土壤（pH 3.6至7.6）到Langdale的酸性较低的土壤（pH 4.7至8.3；表1）。当比较不同地点之间的NH₄⁺浓度时，不考虑树木健康状况，Great monks wood、Winding wood、Langdale和Attingham的NH₄⁺浓度高于Speculation, Chestnuts and Bigwood。这样可以分为两类清晰的地点：（1）铵含量高的地区（Attingham, Great Monks Wood, Langdale, Winding Wood），（2）铵含量较低的地区（Bigwood, Chestnuts, Speculation）。与Bigwood, Chestnuts,Speculation（6.7、6.8和6.8）相比，Attingham，Great Monks Wood和Langdale的NO₂⁻+ NO₃⁻浓度较低（分别为1.7、1.7和2.3gN kg^-1干燥土壤）。研究发现，Winding Wood中的NO₂⁻+ NO₃⁻含量较高，尤其是与无症状树木（23.4kg g⁻¹干土）有关。虽然所有土壤的净硝化潜力普遍较低（支持有症状和无症状的树木），但在Langdale发现最高硝化潜能速率（无症状和有症状），这对应于最高的NH₄⁺浓度。

表1 不同木材研究地点之间与树木健康状况相关的土壤化学性质（中值，最小值和最大值）。

土壤参数与树木健康氮循环基因的关系

AOA的amoA基因丰度范围为2.6×10¹至1.4×10⁵个基因拷贝/g干重土壤，在Chestnuts, Bigwood, Speculation发现的丰度最高，而AOB amoA基因丰度范围为3.1×10 ¹至4.1×10⁵个基因拷贝/g干重土壤，在Winding Wood和Great Monks Wood发现有最高的AOB含量（图2）。同样，硝酸还原酶（nirS，nirK）和一氧化氮还原酶（nosZ）基因的丰度在不同位点也有显著差异: nirS基因的丰度范围为1.4×10³～8.4×10⁵nirs基因拷贝/g干重土壤，nirK基因的丰度范围为2.7×10²～8.7×10⁵基因拷贝/g干重土壤和nosZ基因丰度范围为1.1×10³～2.2×10⁷基因拷贝/g干重土壤。

图2七个英国林地中AOA和AOB氨单氧化酶（amoA）基因拷贝数与有症状和无症状橡树的关系。

我们的先验分段SEM模型为我们的数据提供了令人满意的拟合，如无显著性的Fisher的C P值所示（P=0.977；df=8；图3）。SEM模型显示无症状树比症状树具有更高的AOB amoA基因拷贝（path coeff =0.23；R2=0.07；P=0.008；图3；绿色箭头）。反过来，AOB-amoA基因的丰度受pH值的驱动，在高pH值土壤（path coeff =0.26；R2=0.77；P<0.001；图3；红色箭头）中增加，支持我们的假设，即土壤条件通过调节氨氧化细菌数量间接影响树木健康状况（图3）。相比之下，我们没有观察到AOA-amoA丰度与树木健康之间的联系。AOA丰度主要受土壤NH₄⁺浓度的驱动。出乎意料的是，反硝化基因的丰度与土壤参数及相互之间存在关联，而与树木健康状况无关。C:N是亚硝酸盐还原酶基因丰度（nirS；path coeff=0.22；P=0.01，nirK；path coeff =0.26；P=0.02））的直接主要驱动因素（图3；灰色箭头）。硝酸还原酶基因nirS和nirK相互高度正相关（path coeff=0.73；P<0.001），与一氧化氮还原酶基因丰度(nosZ；path coeff =0.69；0.91; P< 0.001)（图3；灰色箭头）。此外，还发现AOB与nirS（path coeff =0.21；P<0.001），nirK（path coeff=0.21；P=0.007）以及nosZ（path coeff=0.26；P<0.001）基因丰度呈正相关（图3；灰色箭头）。土壤参数也相互关联，进一步证明了土壤、微生物群落和树木健康之间的复杂关系。土壤的pH值很大程度上受C：N比的影响，其中NO₂⁻+ NO₃⁻（path coeff = -0.14；P = 0.04）和NH₄⁺（path coeff = -0.20；P = 0.003），以及土壤总碳（path coeff =0.69；P <0.001）与C：N比负正关系影响C：N比，进而驱动pH（path coeff = -0.21；P <0.05）。水分含量对NO₂⁻+ NO₃⁻（path coeff = 0.39；P = 0.03），NH₄⁺（path coeff = 0.20；P <0.001）和总碳（path coeff = 0.16）有直接的正效应。土壤总碳与NH₄⁺正相关（path coeff =0.34；P<0.001），表明水分和总碳都参与了有机质的矿化作用，影响了NO₂⁻+ NO₃⁻和NH₄⁺浓度（图3；蓝色箭头）。除了与pH呈正相关关系（path coeff = 0.11； P = <0.001）外，还发现水分还可以积极推动硝化作用的潜力（path coeff = 0.08； P = 0.04）。

图3分段结构方程建模的路径图显示了土壤非生物变量和N循环微生物群落对树木健康状况的直接和间接影响。

AOB：AOA比率与树木健康状况之间的关系

由于我们的SEM模型确定了树木健康状况与AOB丰度之间的关联，但没有确定AOA的关联，因此我们进一步研究了每个地点上AOB：AOA比率与树木健康状况之间的关系。不同位点的AOA和AOB基因丰度不同（P<0.001），但是AOB:AOA比率总体而言，根据树木健康状况（P=0.21）没有显著差异。相反，树木健康状况与AOB：AOA比率之间的关系是针对特定地点的。Attingham的AOB：AOA比率（93％）明显高于有症状的树木（63％； P = 0.007）。通常，Winding Wood, Langdale, Great Monks Wood，Attingham的AOB：AOA比率最高，而Bigwood, Chestnuts Wood，Speculation的AOA：AOB比率更高。通过SEM模型分析，我们发现pH值的增加显著增加了AOB:AOA公司（P=0.007），特别是在Bigwood，发现土壤pH>5.8会使AOB从小于24%增加到大于87%，同样，在Chestnuts Wood，pH值> 5.8的土壤的AOB值从34％增加到73％以上（P = 0.004）。尽管NH₄⁺浓度不具有独立于位置的影响，但在Bigwood, Speculation，Chestnuts Wood中较低的NH₄⁺浓度导致AOB显著低于AOA（P=0.001）。

细菌和古菌群落组成

在无症状树木的土壤中，Proteobacteria (41%), Acidobacteria (34%), Actinobacteria (20%)最为丰富，占细菌群落总数的95%。在症状树的土壤中也观察到类似的模式，其中Proteobacteria (40%), Acidobacteria (37%)，Actinobacteria (17%)最为丰富，占细菌总数的94%。在症状树和无症状树的土壤中，Nitrospirae（一种含有亚硝酸盐氧化菌的门）占细菌群落总数的0.02%，在细菌群落中，在无症状和有症状树木的土壤中发现了与硝化有关的五个属（Nitrospira, Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrosococcus, Nitrosospira），这些属在一起占细菌总数的0.8％，根据树木的健康状况，其多样性或相对丰度没有差异。有症状或无症状树木的土壤之间，古菌门水平的组成没有显著差异，并且以Thaumarchaeota 和Crenarchaeota为主（介于57-58％和25-27％之间）。在所有地点，氮循环古菌在有症状和无症状树木的土壤中被发现，包括：Nitrososphaerales (56-57%), Thermoprotei (25-26%), Thermoplasmata (6-7%)， Woesearchaeota Incertae Sedis AR16 (4-5%)。在无症状树和症状树下的土壤中也发现了与硝化作用有关的Nitrososphaera (57%)和Nitrosopumilus (0.8%)。有趣的是，根据树木健康状况的不同，古生物类群甲烷微生物（Euryarchaeota）的相对丰度存在明显差异，在无症状树木的土壤中仅占3%，在有症状树木的土壤中仅占0.06%。

氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）群落组成

经过测序和质量过滤后，获得了265个氨氧化细菌（AOB）OTUs，其中150个与无症状树相关，而157个与症状树相关，尽管不是唯一的。使用Bray-Curtis距离，OTU集群显示了基于位置的不同模式，而不是基于树木健康状况（图4A），并揭示了与其他六个位置相比，Langdale包含的AOB成分不同。然而，根据树木健康状况，在个别地点和OTU水平上存在显著差异。这些差异只发生在三个位置，只涉及两个OTUs:在Winding Wood的有症状树木相关土壤中发现了较高丰度的OTU106（与未培养的amoA细菌克隆具有很高的序列相似性），而在Great Monks Wood and Premission，发现了明显更高丰度的OTU101（P=0.006），其序列也与未培养的amoA细菌克隆高度相似。根据pH值的差异绘制群落差异图，我们发现pH值的差异与群落组成的广泛水平变化有关（图4B）。古菌amoA基因测序鉴定55个OTUs。在不同位置，无症状树与41个OTUs相关，而症状树与43个OTUs相关。与AOB一样，AOA群落组成存在明显的位置差异（P=0.009），但不随树木健康状况而变化（P=0.74）。在Winding Wood和Attingham没有获得古菌amoA序列，这一结果得到了qPCR发现的这些地点amoA AOA丰度较低的支持。

图4 氨氧化细菌（amoA）和一氧化二氮还原细菌（nosZ）在不同位置（A、C）的群落组成差异及其与土壤pH（B、D）差异的关系。在NMDS图（A，C）中，距离较近的点表示更相似的群落。在B，D中，点表示群落之间的成对比较，其中0表示两个相同的群落，而1表示两个没有共同OTUs的群落。

反硝化细菌群落组成

过滤后，在七个树林中获得了1135个一氧化二氮还原酶（nosZ）OTUs和146个和亚硝酸盐还原酶（nirS）OTUs。Permanova分析表明，nosZ和nirS群落在症状树和无症状树之间都没有明显的差异。相反，空间差异和土壤pH值解释了nosZ群落的组成（图4C，P<0.01），而nirS群落只观察到了位置差异。对于nirS群落，没有一个土壤参数显示出与群落组成的任何关系，表明空间变量和其他未观察到的土壤变量驱动了nirS组成。

系统发育分析

AOB amoA基因的系统发育分析表明，Nitrosospira sp在不同位置的AOB amoA基因库占主导地位（图S3），其中一个OTU（OTU50）与N.briensis分到一个组，而其余OTUs与未培养的amoA细菌克隆分到一组。大多数OTUs与Nitrosotalea sp.在不同地点聚集在一起。与N. devanaterra和Nitrosopumilus martimus分组在一起的OTU1，与OTU 43和OTU 53密切相关。通过对反硝化菌和亚硝酸还原酶（nirS）基因测序的分析，确定了两个和假单胞菌（Pseudomonas sp。）分到同组的OTU（OTU43和OTU30）。而其他OTUs显示出与Azospirillum sp.和Cupriavidus sp.有一定的相关性，大多数序列是通过未培养的细菌nirS基因克隆进行分组的。同样，通过分析一氧化氮还原酶（nosZ）基因，确定了与Bradyrhizobium sp.和Mesorhizobium sp.相关的两个分支，其中大部分OTU与未培养细菌nosZ基因克隆（图S6）分组在一起，包括OTU1、4、6、22、27、44，50个与Genbank上任何参考类群的同一性低于80%，并形成一个独特的类群。

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天昊生物除了在16S扩增子绝对定量测序和常规16S/18S/IT扩增子测序极具特色和优势外，在微生物功能基因扩增子测序领域也具有非常丰富的项目经验，目前已经承接了很多氮循环（nifH、narG、nirK、nirS、norB、nosZ、amoA）和磷循环（phoD、phoC）等功能基因扩增子测序项目，我们期待成为您微生物研究领域的优质服务合作伙伴，

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