天昊微生物项目文章：吗啡诱导的条件性位置偏爱不同阶段肠道菌群的变化

发稿时间：2020-12-06来源：天昊生物

西安交通大学卫健委法医学重点实验室和生物证据研究院近期在神经科学著名期刊《Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry》上发表了吗啡诱导的条件性位置偏爱不同阶段中肠道菌群变化的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的相对定量扩增子测序和生信分析工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

物质成瘾是一种涉及遗传和环境因素的慢性复杂疾病。在上述因素的共同调控下，肠道微生物群的扰动已被证明在许多神经精神疾病的发展中起着至关重要的作用，包括成瘾。然而，在吗啡成瘾的不同阶段，肠道微生物群的变化特征仍然没有阐明。在本研究中，我们收集小鼠在吗啡诱导的条件性位置偏爱（CPP）的获得期（对照组和吗啡组）、消退期和恢复期的粪便样本，用16S rRNA扩增子测序检测肠道微生物组成。我们观察到吗啡处理后，菌群丰富度增加，禁食4周后降低。吗啡诱导CPP后，Verrucomicrobia数量增加，Bacteroides数量减少，消退期呈恢复趋势。确定了表征吗啡CPP不同阶段的几个特征菌属。CPP不同阶段丰度差异微生物类群的功能主要集中在氨基酸代谢途径上。综上所述，我们的发现将扩展肠道微生物失调与阿片类药物诱导的奖励或强化行为之间的联系。

物质成瘾的特征是强迫性药物寻求或服用、戒断症状和复发的循环。根据2018年世界毒品报告，全球超过3400万人受到非法和处方类阿片成瘾的影响，阿片滥用致死人数占物质滥用死亡总人数的76%，然而，阿片类药物成瘾不同阶段的机制仍不清楚。虽然环境因素也是重要的基础，但大多数研究都集中在遗传和神经生物学方面。肠道是外部物质成分（如饮食和口服药物）与内部生态系统沟通的最大门户和场所，在遗传和环境因素的共同调控下，肠道微生物群的失调已被证明有助于神经精神疾病的发展，如抑郁症、自闭症谱系障碍（ASD）、精神分裂症和物质成瘾。便秘，腹胀，恶心和呕吐经常发生在使用阿片类药物治疗疼痛的个体中。吗啡给药后，大鼠和小鼠的胃肠运动均受到抑制。除阿片类药物对肠神经系统肌间神经丛的调节外，阿片类药物使用者的胃肠道症状在一定程度上可能是药物引起的肠道微生物群扰动的影响。肠道微生物群及其代谢产物如5-羟色胺和5-羟色胺酸已被证明是调节胃肠道平滑肌运动的因素。越来越多的证据表明，阿片类物质会引起肠道微生物群组成的变化。持续吗啡治疗可诱导小鼠粪肠球菌数量增加，导致小鼠产生镇痛耐受。间断注射吗啡后，瘤胃球菌相对丰度增加，乳酸菌减少。阿片类药物引起的肠道微生物群改变可能与肠道上皮完整性受损、屏障通透性增加、免疫反应失调和细菌易位有关。此外，阿片类药物对中枢神经系统的影响还可以通过交感神经和副交感神经/迷走神经（称为自主神经系统）以及下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴等神经内分泌系统调节肠道微生物组分。肠道微生物群的变化反过来也可以调节成瘾行为。抗生素治疗可减少肠道微生物群，提高小鼠对可卡因行为影响的敏感性。肠道微生物群对成瘾性疾病的调节可能有几个潜在的机制：首先，肠道微生物可以与宿主神经内分泌系统相互作用，从而改变成瘾行为；其次，多巴胺和5-羟色胺在物质成瘾的突触可塑性、奖赏和强化效应中起着重要作用，肠道微生物群是体内多巴胺和血清素的来源，这些神经递质可以作为肠道微生物群通过肠-脑轴调节成瘾的介质；此外，压力状态和抑郁是成瘾发生的重要危险因素，肠道微生物群的扰动被认为在压力和抑郁中具有致病作用，因此，肠道微生物可以通过这些消极情绪状态间接影响成瘾行为；此外，一些微生物的代谢物，如丙酸盐，可以通过肠道-血液和血液-脑屏障，导致神经活性作用，可能影响成瘾的发展。肠脑轴为肠道菌群与物质成瘾之间的相互作用提供了途径。然而，对阿片类药物成瘾的不同阶段中肠道微生物组的特征组成知之甚少。在本研究中，建立了吗啡诱导的CPP的获取，消退和恢复的小鼠模型。通过16S rRNA扩增子测序检测肠道菌群的多样性和群落丰富度。对吗啡诱导的CPP不同阶段的微生物组成进行了差异分析，以更全面地了解吗啡诱导CPP各阶段对应的代表性微生物群概况。利用KEGG数据库对CPP阶段间丰度差异的微生物群落类群进行功能富集分析。我们的研究发现，吗啡诱导的CPP的获得、消退和恢复引起肠道微生物群的差异性变化，包括Verrucomicrobia 和Bacteroide，它们主要在氨基酸代谢的功能途径中富集。

实验设计

成年雄性C57BL/6 J小鼠，8周龄（N=20，体重21.2-24.1g），每个单独通风的笼子（IVC）放置3-4只（对照组和吗啡组分别安置），在12/12h明暗循环下（早上7:00到晚上7:00亮起），并且可以自由获得无菌食品和水，室温保持在23±2°C，湿度保持在55±5%。在实验前，所有小鼠适应7天，并生理盐水注射3d（适应注射）。所有动物程序均获西安交通大学动物护理与使用委员会批准，并符合《英国动物（科学程序）法》第1986条和美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南（NIH出版物第8023号，修订版1978）。CPP预处理前腹腔注射吗啡（10mg/kg）或生理盐水。本研究采用三阶段CPP程序，包括获得、消退和恢复。CPP装置有两个隔室（每个隔室30×16×35cm）。A隔室的背景为1厘米宽黑白相间的水平条纹和网格地板。B隔室背景1厘米宽黑白相间的纵向条纹，地板光滑，这两个部分可以通过打开或关闭闸门来连接或隔离。通过DigBehv软件记录并分析每个隔间中停留的时间。对于获得阶段，第1天，让小鼠习惯性地在两个隔室之间自由移动15分钟，在第2天，让小鼠探索两侧，以确定基线偏好（预适应），并记录每侧停留的时间；在第3、5、7、9、11、13天，给小鼠注射吗啡（吗啡组）或生理盐水（对照组），然后关在A隔室45min，在第4、6、8、10、12、14天，所有小鼠（对照组和吗啡组）均注射生理盐水，然后将其关在B室45min（条件反射）；在最后一次注射后24小时，让小鼠自由进入整个装置，不进行任何注射，持续15分钟（偏好试验）；对于消退阶段，吗啡组的小鼠被关在笼子里，没有任何注射，在偏好试验之后（在第22、29、36、43天等），每周都会对位置偏好进行测试，以确定吗啡诱导的CPP是否消退。24小时后，在没有CPP效应的情况下，小鼠注射吗啡一次，然后进行位置偏爱试验（恢复试验）。在每个位置偏爱测试中，小鼠被随机放置在仪器的两侧。

粪便样品收集和DNA提取

在吗啡诱导的CPP获得期（对照组和吗啡组）、消退期和恢复期（每次行为测试后6h）用腹部按摩法收集每只小鼠的粪便标本，然后，立即用液氮冷冻粪便样本，并在−80°C下储存直至使用。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit进行DNA提取，粪便DNA在−80°C下保存，直到扩增。

高通量测序和分析

16S rRNA扩增子测序（V3-V4），由我公司提供服务。

吗啡诱导的CPP的获得、消退和恢复

吗啡组与对照组比较，吗啡组大鼠成功地建立了位置偏爱（P<0.0001）。然后，吗啡组小鼠在禁食吗啡数周，直到CPP效应消失。在第43天（禁食4周后）将小鼠放回CPP室时，小鼠对任何一侧都没有持续的偏好（预适应与消退，P=0.828）。第44天，小鼠在恢复试验前用10mg/kg吗啡预处理。我们的结果表明，恢复期的CPP评分明显高于预适应阶段（P=0.015）（图1A）。

CPP不同阶段群落多样性的变化

关于总的α多样性，在吗啡诱导的CPP的不同阶段之间，微生物组群落的丰富度和多样性均存在显著差异（FDR值见表S1A）。成对比较显示，与对照组相比，重复的吗啡条件反射可导致较高的丰富度，但不会导致群落的多样性（表S1B）。禁食四周后，物种丰富度和多样性（Shannon指数）与获得阶段相比有所下降（表S1C）。虽然一次吗啡激发成功地触发了CPP，但我们没有观察到微生物群落在恢复期和消退期之间的变化（表S1D）（图1B）。对于微生物群落的β多样性，PCoA结果显示吗啡诱导的CPP的不同阶段通过非参数方差分析（P=1E-04，图1C）可明显的分别聚集在一起。吗啡CPP组（获得期）与对照组明显分离。相对于获得期，消退期与对照组更为相似。与获得期相比，在恢复期和消退期之间发现了更多的重叠，这种现象在主坐标分析（PCA）图中更为明显（图S1）。

CPP阶段间的物种丰度差异

在门水平上，吗啡CPP组Verrucomicrobia的平均丰度显著高于对照组（FDR=0.022，表S2A）。Bacteroidetes（FDR=0.022）在消退期较高，Verrucomicrobia（FDR=0.022）和Candidatus_Saccharibacteria（FDR=0.011）在消退期低于获得期（表S2B）。然而，在恢复期与消退期没有发现差异（FDR>0.05，表S2C）。恢复期的Candidatus_Saccharibacteria丰度（FDR=0.005）低于获得期（表S2D）（图2A）。在属水平上，吗啡CPP组（获得期）Bacteroides的丰度（FDR=0.025）低于对照组（表S2E）。消退期低于获得期，Bacteroides（FDR=0.026）和Coprobacter（FDR=0.011）丰度较高，Akkermansia，Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，Eisenbergiella，Ruminococcus (all FDRs = 0.011)丰度较低（表S2F）。然而，消退期和恢复期之间没有显著差异（FDR>0.05，表S2G）。与获得期相比，在恢复期，Bacteroides（FDR=0.016）和Coprobacter（FDR=0.013）的丰度更高，而Eisenbergiella (FDR = 0.013)，Saccharibacteria_genera_incertae_sedis (FDR = 0.016) 和 Clostridium_XlVa (FDR = 0.016)的丰度较低（表S2H）（图2B）。

CPP不同阶段的生物标志物

LEfSe分析被用来确定最能描述吗啡CPP各个阶段的特殊分类群。根据相应的LDA评分，Bacteroides，Parabacteroides，Clostridium_XlVb，Eisenbergiella，Anaerotruncus，Rhizobium和Bilophila为对照组的代表属。Alistipes，Anaerovorax，Clostridium_IV，Ruminococcus，Aestuariispira和Akkermansia是吗啡CPP组获得期最丰富的属。消退期是以Parvibacter/Coprobacter的比例过高来区分的。在恢复期，Lactobacillus，Anaerovorax，Escherichia_Shigella是代表性的菌属（图3A和B以及表S3）。

CPP阶段间差异富集微生物群的功能诠释

就菌群功能富集程度，与对照组相比，在CPP组的获得期，信号转导机制和复制、重组和修复蛋白在内的通路增加，而烟酸和烟酰胺代谢，氮代谢和氰胺酸代谢途径减少（图4A和表S4A）。与获得期相比，在消退期，包括组氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸相关酶、蛋白质输出和核糖体生物生成的途径增加，双组分系统途径减少（图4B和表S4B）。与消退期相比，在恢复期，离子偶联转运体和糖酵解/糖异生的途径增加，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、细菌分泌系统、精氨酸和脯氨酸代谢以及氧化磷酸化有所降低（图4C和表S4C）。与获得期相比，在恢复期，核糖体生物发生、嘌呤代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、氨基酸相关酶、DNA修复重组蛋白和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径增加，双组分系统减少（图4D和表S4D）。