期刊名： Annals of Neurology
影响因子：9.037
发表时间：2020年12月3日
目的：帕金森病（PD）肠道微生物组改变已被反复报道，但其功能相关性仍不清楚。粪便代谢组学提供了微生物活性的功能性读数，但很少有人对其进行研究。我们研究了帕金森病患者粪便微生物组和代谢组的改变及其临床相关性。
方法：200例受试者（104例PD患者，96例对照）接受临床表型分析。粪便样本用16S rRNA扩增子测序分析。粪便代谢组学采用核磁共振（NMR）和液相色谱-质谱两种平台进行。
结果：PD患者中的粪便微生物组和代谢组组成与对照组明显不同，基于NMR的代谢组的影响最大。经过全面的混杂因素分析后，微生物组和基于NMR的代谢组组成差异仍然很大。与对照组相比，差异粪便代谢物和预测的功能变化包括具有神经保护作用的生物活性分子（如短链脂肪酸[SCFAs]、泛醌和水杨酸盐），以及其他与神经退行性变密切相关的化合物（例如神经酰胺、鞘氨醇和三甲胺N-氧化物）。在PD组，认知障碍、低体重指数（BMI）、虚弱、便秘和低体力活动与粪便代谢组分差异有关。值得注意的是，PD患者低水平SCFAs与认知能力差和低BMI显著相关。较低的丁酸水平与较差的姿势不稳定步态障碍评分相关。
帕金森氏病（PD）是一种越来越普遍的与年龄相关的神经退行性疾病。尽管PD在临床上是由运动功能定义的，但非运动功能（包括胃肠道（GI）症状，体重减轻和认知功能障碍）会大大增加疾病负担。PD的发病机制涉及与环境暴露（包括毒素和传染源）相互作用的复杂多基因因素。由于胃肠道既是暴露于病原体和吸收抗帕金森病药物的主要场所，肠道感染和微生物群-肠-脑轴在帕金森病中的作用已成为该领域的一个重要课题。较早的研究表明，PD患者中上消化道微生物变化（幽门螺杆菌感染和小肠细菌过度生长[SIBO]）与运动严重程度和运动反应并发症存在关联。随着NGS技术的日益普及，对肠道下层微生物群的研究也越来越多。PubMed对截至2020年5月1日发布的研究进行了搜索，使用搜索词（“Microbiota OR Microbiome OR Dysbiosis OR Microflora”）和（“Parkinson” OR “Parkinsonism”）进行了检索，得到了22项独立独的病例对照粪便微生物组学NGS研究。三分之二的研究样本量<55例帕金森病患者；来自欧洲和北美的三项较大的研究包括≥100名帕金森病患者。混杂因素分析在大多数情况下是有限的，只有少数研究，例如，控制饮食摄入。虚弱，与老年人的肠道微生物群密切相关，目前还没有将其作为混杂因素进行研究。帕金森病的研究表明，与对照组相比，肠道微生物组群存在显著差异，尽管常常不一致。此外，这些微生物成分变化的功能后果仍不清楚。一些研究根据预测的功能基因图谱推断微生物群的功能，但人类微生物群中的大多数基因尚不能进行功能分配，它们的动态转录和翻译活性有待阐明，这强调了多组学方法的必要性。在最近的一项PD微生物组学研究中，对一组受试者进行了血清代谢组学（主要反映宿主代谢物），发现两种蛋白质降解副产物和几个细菌属之间存在相关性。另一方面，粪便样品包含多种分子，这些分子反映了肠道细菌和宿主胃肠道对养分的吸收，消化，吸收和代谢的最终结果。因此，粪便代谢组学分析可以提供对肠道微生物组如何影响疾病或如何受疾病影响的最接近的理解，是研究各种疾病中肠道微生物与宿主相互作用最广泛的方法。最近的一项研究利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析了64名帕金森病患者和51名对照者的粪便样本，发现了几种脂类、维生素、氨基酸和其他有机化合物的组间差异。由于不同的平台（GC-MS、LC-MS和NMR）对不同种类的代谢物具有互补的敏感性，因此越来越多地建议使用一个以上的分析平台。在这项工作中，我们采用了一种无偏见的方法来揭示PD患者中重要的肠道微生物和代谢物变化，使用16S rRNA扩增子测序和两个非靶向代谢组学平台（NMR和LC-MS）来增加代谢物的覆盖范围。使用多变量模型对大量临床表型，微生物组和代谢组学数据进行整合和分析，以了解肠道微生物生态系统及其与PD的相关性。
样本：
PD患者（n=104）与配偶（n=91）或兄弟姐妹（n=5）一起从UMMC神经内科门诊部连续招募，并生活在同一社区（以尽量减少饮食、生活方式和住房条件等因素的潜在混淆）。帕金森病神经科医生根据标准的临床诊断标准对PD患者进行诊断。所有受试者的排除标准包括：前三个月内使用抗生素；前一个月内使用益生菌；长期护理住院；管饲饮食；无法完成研究评估；此外，对于帕金森病患者：在前三个月内开始服用抗帕金森病药物或在前一个月内进行调整。
临床评价：
收集人口统计学、医学和体重指数（BMI）数据。膳食摄入量采用当地验证的食物频率问卷（FFQ）进行评估，该问卷由136种食物组成，并由合格的营养学家进行分析。分别采用利兹消化不良问卷（LDQ）、便秘症状问卷（PAC-SYM）、蒙特利尔认知评估（MoCA）和国际体力活动问卷评估消化不良、便秘、认知功能和体力活动。步态速度是通过定时起跳测试来测量的，而优势手握力则是用数字测功机来评估的。
采用两种方法评估脆弱性：（1）表型模型包括五个领域（意外体重减轻、疲劳、低体力活动、步速受损和握力差），将三种缺陷的受试者分为虚弱、1-2个缺陷前脆弱、零缺陷非虚弱；（2） 累积缺陷模型包括40个具有二分式结果（是/否）的项目（包括共病，以及生理、认知-心理、视觉/听觉和生理学领域）；积极反应的数量除以40得出脆弱指数得分，>0.2作为脆弱性分类的临界值。使用运动障碍学会统一帕金森病评定量表（MDS-UPDRS）在“服药”状态下评估PD严重程度。
使用全身双能X线骨密度仪对78位患者和66位对照的亚组进行了身体成分评估。肌萎缩症的分类依据是骨骼肌重量低、握力差或步速受损。
16S rRNA扩增子测序：
粪便样本收集在无菌容器中，不添加防腐剂，因为它们会干扰代谢组学分析。立即将样本放在冰上，在到达医院后，在-20°C的温度下保存（大多数情况下，这发生在采集后1-3小时内）。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit进行DNA提取，然后进行16S rRNA扩增子测序（V3-V4）。
NMR非靶向代谢组:
每个粪便样品，重量为0.05g，用氘化磷酸盐缓冲液（D2O:H 2O，v/v，1:1；pH 7.4）均质化，缓冲液中含有3-（三甲基硅烷基）丙酸钠-2,2,3,3-D4（TSP），并使用3mM叠氮化钠。匀浆在环境温度（25°C）下超声处理30分钟，并在11000g下离心10分钟。将上清液（600μL）用移液管移入5毫米核磁共振管中。
如先前所述进行NMR数据采集。200个样本中有两个没有产生可读的光谱，因此被排除在外。使用TopSpin对所有光谱进行手动定相并进行基线校正，并参考δ0·00处的TSP共振。使用内部开发的MATLAB脚本将完整的光谱（δ0·0–10·0）数字化为7,000个数据点。去除仅包含噪声和水共振的区域。对每一个谱进行归一化处理，得到残差谱的总和，所有数据均为单位方差标度。根据指定代谢产物的NMR信号峰面积计算所选代谢物的相对浓度，然后计算这些代谢物的峰面积与肌酐峰面积的比值（δ4.04）。
LC-MS非靶向代谢组检测:
将150mg粪便悬浮于3mL LC-MS级水中，并以1:3的比例用水进一步稀释。将50μL稀释粪便浆与500μL甲醇均质，并在12000g下离心10分钟。将上清液与2mL甲基叔丁基醚/六氟异丙醇（MTBE）混合，室温下孵育10分钟。加入1.5mL水，5000g离心5min，诱导相分离。将含MTBE的顶部脂质层和底部的甲醇和水层收集在单独的试管中，在CentriVap浓缩器系统中于4℃下干燥，然后重悬于500μL的乙腈：异丙醇：水（ 65：30：5）。将20µL溶解的代谢物注入液相色谱系统。
如前所述，在154个样品（77位患者和77位对照）中进行了LC-MS数据采集。通过自动将离子特征与LC-MS个人化合物（METLIN）数据库进行比较，对代谢物进行注释，该数据库包括分子量（m / z），首选加合物和源内碎片以及相关的（MS）质谱图，并使用Mass Profiler Professional软件通过目视检查进行质量控制。在<20％的样品中测得的代谢物被排除在进一步分析之外。在437种经过滤的代谢产物中，有352种基于METLIN数据库具有已知化学特征，并被包括在下游分析中。
受试者的人口学和临床特征见表1。帕金森病患者与对照组在生活方式因素（包括饮食摄入）和合并症方面没有显著差异。90％的PD患者处于Hoehn和Yahr 2和2.5期。PD严重程度与饮食消费模式无关；即MDS-UPDRS第III部分得分与总热量摄入、总纤维摄入量或常见食物类别（米饭、面条、面包、谷类食品、肉类和鸡肉、海鲜、鸡蛋、牛奶、汤、豆类、蔬菜和水果）的摄入量没有关联（斯皮尔曼rho范围为0.003至0.136）。
粪便微生物组分和代谢组分的组间差异
16S rRNA扩增子测序微生物组的α多样性和基于LC-MS的代谢组组成的α多样性在组间没有显著差异。与对照组相比，帕金森病患者预测的BioCyc途径稍有不同（香农指数=5.57 vs.5.54；p=0.013）。PERMANOVA分析显示16S rRNA微生物组、NMR代谢组和LC-MS代谢组对疾病状态（PD与对照）有显著影响（表2），但对BioCyc途径途径没有影响（R2=0.005，p=0.33）。与16S rRNA微生物组和LC-MS代谢组相比，PD诊断在基于NMR的代谢组中的影响更大（R 2=0.023 vs.0.018和0.010）。16S rRNA微生物组整体组成，BioCyc途径，基于NMR的代谢组和基于LC-MS的代谢组之间的相关性很差（Spearman's rho 0-0.08）。
表2 帕金森病诊断和协变量对粪便微生物组和代谢组组成整体差异的贡献
人口统计学，饮食，合并症，胃肠道症状，认知功能，虚弱和药物的影响
使用PERMANOVA将47个变量（包括年龄，性别，种族，吸烟状况，BMI，饮食摄入，身体活动，合并症，消化不良，便秘，认知功能，虚弱和使用非抗帕金森病药物）评估为潜在混杂因素（补充表2）。消化不良的严重程度，虚弱以及使用抗抑郁药对粪便微生物组的组成具有显著影响（p <0.05），而年龄，种族，几种饮食因素，认知功能，虚弱以及使用抗精神病药和钙通道阻滞剂对粪便代谢组的组成有显著影响（补充表2）。所有p<0.1的非共线变量被视为潜在的混杂因素。在控制这些混杂因素的多变量模型中，发现PD状态对粪便微生物组和基于NMR的代谢组分有显著的独立影响，但对基于LC-MS的代谢组分没有影响（表2）。在PD亚组分析中，抗帕金森病药物对粪便微生物组或代谢组组成没有显著影响（补充表3）。
图1根据校正后的P值阈值<0.01，总结了PD与对照组中差异的微生物和代谢物特征。在特征水平上，PD中有10个细菌类群显著增加（图1A），Bacteroides fragilis, Lactobacillus acidophilus, Megasphaera,Gammaproteobacteria的变化最大。预测的功能途径分析显示，除其他外，PD中水杨酸盐降解salicylate degradation和葡萄糖基甘油酯生物glucosylglycerate biosynthesis合成途径上调，而胆碱生物合成choline biosynthesis和胆汁酸降解bile acid degradation途径下调（图1B）。基于LC-MS，包括长链饱和脂肪酸（17十八烷酸和顺式-9,10-环氧硬脂酸）和鞘脂（神经酰胺[Cer（d14:1（4E）/22:0（2OH）]和脱氢卟啉戈辛dehydrophytosphingosine）在PD中增加，而泛醌（辅酶Q6和Q9）和另一种神经酰胺（Cer（d18:0/14:0））与对照组相比减少（图1C）。基于NMR，粪便中丁酸盐、氨基酸（谷氨酸盐和酪氨酸）和胆碱代谢底物（胆碱、磷酸胆碱、三甲胺、氧化三甲胺[TMAO]）和能量代谢（丙酮酸和富马酸盐）水平降低，但糖酵解产物（乙醇和青蟹木糖醇）水平更高（图1D）。我们使用零膨胀负二项GLM来控制与粪便微生物组和代谢组分相关的混杂因子（如表2所示）。经过这一严格的过滤程序，五个细菌类群（Lactobacillus acidophilus, Clostridium saccharolyticum WM1, unclassified Gammaproteobacteria, genus Cloacibacillus, genus Christensenella）和4种代谢物（17-十八烯酸、顺-9,10-环氧硬脂酸、去甲酰鞘氨醇和辅酶Q6）仍然显著与PD有关。
PD患者粪便微生物组和代谢组改变的临床意义
首先，我们使用PERMANOVA调查了20个先验因素（包括与PD相关的特征，身体组成，虚弱和生活方式因素）对PD患者总体微生物组和代谢组组成的影响（表3），在Bonferroni校正后，在显着性阈值p <0.0025处进行多次比较后，我们没有发现显著关联。根据未经校正的Permutation置换检验（Permutation数量= 1,000，p <0.05），认知障碍，体弱，低体重指数（BMI），低体力活动和便秘与粪便代谢组学组成差异有关，而与粪便微生物组组成差异无关。
表3 帕金森病患者疾病相关特征、身体组成、虚弱和生活方式因素与粪便微生物组/代谢组组成的关系
通过使用与上述阈值相似的Permutation置换检验（针对基于NMR的代谢组）和DESeq2（针对基于LC-MS的代谢组），通过表征与这些因素相关的特定代谢物特征，进一步探索了这些趋势，值得注意的是，发现患有认知障碍（MoCA <26）和低BMI（<20kg / m 2）的PD患者的SCFA水平明显降低（图2）。身体虚弱或身体活动低下的患者没有特定的代谢物被分解（这两个亚组中，其中一个丁酸盐光谱峰显著降低，但与丁酸盐相对应的另外两个峰值未检测到类似的变化）。
接下来，我们研究了在帕金森病中显著富集的细菌类群、代谢产物和预测通路之间的相关性。总体而言，相比细菌特征、基于LC-MS的代谢物或预测的功能途径，临床变量与基于NMR的代谢物之间存在更直接和更显著的相关性（图3）。
当对差异丰富的细菌属进行相关性网络分析时，也得到了类似的观察结果，选定的相关关系（Spearman的rho = 0.279-0.326）在图4中用散点图表示。丁酸盐Butyrate与姿势不稳定步态障碍（PIGD）评分和便秘严重程度（PAC-SYM）呈负相关。几种粪便代谢物，包括丙酮酸pyruvate、胆碱choline和乙醇ethanol，与运动波动motor fluctuations和运动障碍dyskinesia的严重程度相关（图3和图4）。与散点图中观察到的模式一致，组间比较显示，运动反应并发症（MRC）患者的粪便丙酮酸pyruvate水平显著低于无运动反应并发症的患者（p=0.035），而MRC患者的粪便乙醇和胆碱水平则更高（p=0.001和0.004）。事后分析（Post hoc analyses）显示，这三种代谢物还与与MRC密切相关的两个因素相关，即LEDD（Spearman's rho范围为0.283-0.391，p值为0.001-0.018）和PD持续时间（Spearman's rho为0.232-0.309，p值为0.009-0.053）。
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