天昊微生物项目文章：pH引起的真菌丰度和组成的变化会影响人工控制pH值30天后的土壤异养硝化作用

发稿时间：2020-12-29来源：天昊生物

异养硝化作用广泛发生，对酸性土壤中NO₃^–的产生具有重要意义。然而，低土壤pH值是否刺激异养硝化作用尚不清楚，潜在的微生物驱动因素也不清楚。因此，在中国亚热带森林（森林土壤SF初始pH为4.5）和农田（农田土壤SC初始pH为5.5）土壤中，控制pH梯度（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）来说明土壤pH对异养硝化作用的影响。调节pH 30天后，用1% C₂H₂抑制自养硝化作用，通过¹⁵N-标记实验揭示异养硝化作用。在30天的pH调节过程中，还确定了土壤微生物特性（例如真菌和细菌的组成以及丰度），以研究异养硝化的潜在微生物驱动力。结果表明，初级异养硝化速率从pH 7.5处理的<0.3 mg N kg⁻¹ d⁻¹增加到pH 3.5处理中的>1 mg N kg⁻¹ d⁻¹，在森林土壤SF和农田土壤SC的低pH处理中，异养硝化作用对总硝化作用的贡献率提高到60%以上。随着土壤酸化，异养硝化过程中有机氮的使用量大于无机氮基质。真菌与初级异养硝化速率呈显著正相关（P<0.01），与异养¹⁵N-NO₃^–产生对总¹⁵N-NO₃^–产生的贡献呈正相关（P<0.01），说明真菌是酸性土壤中异养硝化菌的优势菌。此外，在我们所研究的酸性土壤中，Phialocephala、Chlorium和Tararomyces可能具有异养硝化作用。本研究表明，土壤pH值的降低会影响真菌的数量和组成，进而在短期内促进异养硝化作用。

异养硝化作用广泛发生，对酸性土壤中NO₃^–的产生具有重要意义。而自养硝化通常会在低pH条件下受到阻碍，因为自养硝化底物（NH₃）的可用性和自养菌的活性（例如氨氧化细菌（AOB），亚硝酸盐氧化细菌（NOB）Nitrospira和Nitrobacter）是有限的，尽管氨氧化古细菌（AOA）被认为比AOB更为丰富，并且在酸性土壤中负责自养硝化。通常，土壤pH被认为与异养硝化速率高度相关，并且与异养硝化速率呈负相关关系，进一步证明了森林，草地和耕地土壤中异养硝化速率的pH阈值（大约在pH = 6.0），在pH> 6.0时似乎可以忽略不计。然而，一些先前的研究观察到，在pH值为3.8的森林土壤中，异养硝化速率较低（0.01 mg N kg⁻¹ d⁻¹），而在pH值较高（pH>6）的森林土壤中，异养硝化速率相对较高（>1 mg N kg⁻¹ d⁻¹）。迄今为止，土壤pH值对异养硝化速率的影响尚不清楚。此外，一些研究使用异养硝化速率与总硝化速率之比来描述土壤异养硝化过程的重要性，并观察到该比率随土壤pH值降低而增加。但是，异养硝化的比例很高（平均> 60％）可能是由于其在酸性条件下（平均<0.1 mg N kg⁻¹ d⁻¹）平行的低自养硝化速率所致，而不是表明异养硝化速率很高（平均< 0.2 mg N kg -1天-1）。此外，其他土壤变量，如土壤C含量和C:N比值，往往与pH值相互作用，并与异养硝化速率呈正相关。因此，土壤pH值对异养硝化作用的影响可能受土壤C和N含量的影响。目前还没有证实土壤pH状况会独立影响异养硝化作用。因此，需要通过人工pH调控实验来研究土壤pH对异养硝化作用的影响，部分排除土壤C、N含量的影响。土壤真菌和嗜酸细菌被认为是潜在的异养硝化菌。异养硝化菌，真菌如Basidiomycetes, Aspergillus, Penicillium, Mortierella, Trichoderma, Verticillium,，以及细菌如Arthrobacter, Paracoccus, Thiosphaera, Pseudomonas, Denitrificans等，在20世纪被分离出来，这些微生物在培养基中能从铵态氮和有机氮中产生亚硝酸盐或硝酸盐。一般认为，真菌在低pH条件下比其对应的细菌更有效地进行异养硝化，因为它们更耐酸。以往的研究表明，真菌能氧化土壤有机氮和铵。在酸性土壤中，氨主要转化为铵（NH3/NH4+pKa=9.24），这是否为真菌提供了进行异养硝化作用的机会尚不清楚。了解真菌和细菌对土壤pH变化的响应及其在异养硝化作用中的作用，有助于更好地了解pH对异养硝化作用的影响。本研究通过在中国亚热带酸性森林（初始pH值4.5）和农田土壤（初始pH值5.5）中添加不同量的H₂SO₄（1M）或CaO，建立了一个pH梯度（ph3.5，ph4.5，ph5.5，ph6.5，ph7.5）来研究异养硝化速率和异养硝化菌的pH响应。我们结合C₂H₂抑制剂、¹⁵N同位素示踪技术和分子生物学方法来阐明土壤pH值对异养硝化作用的影响机理。

土壤样本

本研究使用的土壤采集于江西省Shuangzhen Forestry Center（北纬27°59′，东经117°25′），其特征是典型的亚热带气候（年平均气温为18.4°C，年均1785毫米）。选择了森林和农田两种不同的土地类型进行土壤采样。林地以马尾松和杉木为主，土壤类型按美国土壤分类学分类为湿润老成土。农田（在过去十年里，从森林中复垦出来并获得200-300 kg N ha⁻¹ yr⁻¹氮肥）种植着花生。对于每种土地类型，随机选择4个地块（~4 m×4 m），移除O层（有机层）后，在每个地块上采集一个复合表土样品（0-20 cm）。然后将这四个复合土壤样本汇集在一起，通过2 mm的筛子，并在4℃下储存以进行培养实验。森林和农田土壤样品分别定义为森林土壤（SF）和农田土壤（SC）。SF和SC的原始土壤pH值分别为4.5和5.5；SF和SC的土壤有机碳（SOC）和全氮（TN）分别为26.64 g kg⁻¹、1.37 g kg⁻¹和6.47 g kg⁻¹、0.59 g kg⁻¹。

土壤pH调控及¹⁵N同位素标记试验

结合¹⁵N标记技术进行土壤pH调节，以研究人工pH调节对异养硝化作用，土壤微生物丰度和群落的影响。对于每种pH处理，准备了54个烧瓶（250 mL），然后每个烧瓶都装有20 g新鲜土壤（以干土重量计）。通过添加不同量的H₂SO₄（1 M）或CaO（表1）来调节土壤pH，使SF和SC的pH梯度分别为3.5、4.5、5.5、6.5和7.5（图S1a）。pH调节后，所有烧瓶在25℃恒温培养箱中培养，培养期间土壤样品保持40%的持水量。在第0天、第15天和第30天随机选择三个烧瓶进行DNA提取和微生物定量，同时，在每个pH值的第1、2、3、5、7、10、15、20、25和30天，随机选择另外三个烧瓶，以确定土壤CO₂产生速率，在每次CO₂取样之前，用环境空气冲洗每个烧瓶，用塞子密封6 h，然后收集37 mL气体并注入预抽真空的小瓶中，以测量CO₂浓度。然后，在每次CO₂取样后，将三个烧瓶放回培养箱中（图S1a），培养在30天后终止，因为据报告土壤微生物组在培养30天后达到稳定的呼吸状态，并且还立即测量每个DNA提取，以确定微生物丰度变化是否稳定。在培养结束时，随机选择三个烧瓶测量SF和SC组中每个pH处理的pH值（图S1a）。在pH调节30天后，五个处理的平均pH值在SF（3.6、4.6、5.4、6.2、6.8）和SC（3.8、4.2、5.4、6.0、6.7）中呈现出梯度（表S1）。将土壤样品（SF和SC组中每个pH处理土壤样品的42个烧瓶）分为两组，在黑暗中以1 KPa（1%）与添加或不添加C₂ H₂进行培养（图S1b）。为确保自养硝化作用在测试土壤中完全被抑制，将用于C₂ H₂处理的样品预先暴露于1 KPa（1％）的C₂ H₂中一天。然后，使用¹⁵N标记的NO₃^–（以量化初级异养硝化率），¹⁵N标记的NH₄ ⁺和¹⁵N标记的甘氨酸（计算在无机氮处理和有机氮处理下（无论是否使用C₂ H₂处理）的异养¹⁵NO₃^–生成量）一式三份进行¹⁵N标记示踪实验。

土壤理化性质分析

在1:2.5干土水比下测定土壤pH值。使用C:N元素分析仪测定SOC和TN。使用安捷伦7890气相色谱仪测定二氧化碳浓度。土壤溶液中NH₄ ⁺和NO₃^–的浓度使用SAN Plus连续流动分析仪测定，NH₄ ⁺和NO₃^–的同位素组成使用Sercon 20-22测量。

DNA提取与Real-time PCR检测

使用PowerSoil® DNA Isolation Kit从0.25 g新鲜土壤中分离DNA。然后使用Real-time PCR仪器检测以确定真菌（(ITS)1F/5.8s）、细菌（338F/518R）、氨氧化古细菌（AOA）（Arch amoAF/Arch amoAR）以及氨氧化细菌（AOB）（amoA1F/amoA2R）的丰度。

Miseq测序

经过30天的调节和培养，微生物的丰度是稳定的，然后选择30天的DNA提取物通过真菌扩增子测序（ITS1）和细菌扩增子测序（V4-V5）来解读微生物群落对pH调节的潜在反应。

土壤总硝化速率

培养30天后，土壤pH调节对SF和SC的初级异养硝化速率有显著影响（P<0.01）。在SF中，初级异养硝化速率在pH值为3.5（1.25 mg N kg⁻¹ day⁻¹）时最高，其次是pH值为5.5（0.57 mg N kg⁻¹ day⁻¹），pH值为4.5（0.48 mg N kg⁻¹ day⁻¹），pH值为6.5（0.41 mg N kg⁻¹ day⁻¹），pH值为7.5（0.21 mg N kg⁻¹ day⁻¹）时最低。同样，随着pH值的增加，SC的初级异养硝化速率显著降低（P<0.01），在pH 3.5处理（0.85mg N kg⁻¹ day⁻¹）中最高，在pH 7.5（0.25mg N kg⁻¹ day⁻¹）中最低。结果表明，土壤pH值的降低对初级异养硝化速率有显著的促进作用，且随着pH值的增加，这种促进作用逐渐减弱。除pH4.5和pH7.5处理外，相同pH条件下SF的初级异养硝化速率普遍高于SC（图1）。初级自养硝化速率也受到pH调节的显著影响（P<0.05）（图1）。在SF中，调节土壤（pH3.5、pH5.5、pH6.5和pH7.5）的初级自养硝化速率无显著差异（P<0.05），显著高于初始土壤（pH4.5）。与SF的结果不同，在SC的高pH处理中，初级自养硝化速率明显更高（P <0.05），尽管在初始土壤（pH 5.5）中观察到最高的自养硝化速率。土壤初级异养硝化速率与总硝化速率之比随土壤pH值的增加而显著降低（P<0.05），表明土壤pH值显著降低（P<0.05）提高了土壤异养硝化作用的相对贡献率，但不是通过抑制自养硝化作用。

¹⁵ N-NO₃⁻产生

一般来说，在SF和SC中，存在C₂ H ₂时¹⁵ N-NO₃^-的浓度低于没有C₂ H ₂时的浓度（图S2）。在C₂ H ₂存在下，¹⁵N-甘氨酸处理产生的¹⁵ N-NO₃^-一般高于¹⁵N-NH₄⁺处理，除了SF（pH6.5和pH 7.5处理）和SC（pH 7.5处理）中的碱性处理（图S3）。在¹⁵N-NH₄⁺和¹⁵N-甘氨酸处理中，异养¹⁵ N-NO₃^-产生对总¹⁵ N-NO₃^-产生的贡献分别从pH 3.5处理中的78.86％和85.10％降低至 SF的pH 7.5处理的55.97％和67.07％（图2）。同样，对SC的贡献从pH 3.5处理的78.31%和88.93%下降到pH 7.5处理的54.22%和40.87%（图2）。

土壤真菌和细菌的丰度

pH值调节后，细菌的种群大小随着土壤pH的增加逐渐增加，而真菌种群对SF和SC的pH变化无响应（图S4、S5）。在培养过程中，不同pH值下SF中真菌和细菌种群的变化有所不同；但是，培养30天后，真菌和细菌的数量变得稳定（图S4）。在SC中，除了pH3.5处理中的细菌丰度外，在培养期间的所有pH值中真菌和细菌的数量都增加了，并且在培养30天后变得稳定（图S5）。这些结果表明，在本次调查中，土壤微生物在培养30天后达到了稳定状态。在pH调节30天后，真菌数量减少。在pH调节30天后，真菌数量随着土壤pH值的增加而显著减少（P<0.05）（图3），而细菌数量随着pH值的增加而显著增加（P<0.05）（图3）。真菌/细菌(ITS:16S)的比例最高出现在pH值为3.5的处理中，SF（平均0.23）和SC（平均0.29）都出现了这种现象（图3），并且这种比例随着土壤pH值的增加而显著降低（P<0.01）。

真菌和细菌群落结构和组成

质控后得到4531680和4331332条真菌ITS序列，以及3632742和3867433条细菌16S基因序列。重采样后，SF中每个样本的真菌和细菌OTU数量在567-1481和2739-6055之间，在SC中，真菌和细菌OTU的数量在256-1269和1714-7480之间。此外，所有样本对细菌和真菌的覆盖率分别高于95.0%和98.3%，表明本研究的测序深度足以进行多样性分析（表S3）。ANOSIM分析表明，SF真菌群落结构（方差分析r=0.75，P<0.01）和细菌群落结构（方差分析r=0.94，P<0.01）不同pH处理间有显著差异。PCoA分析显示，pH 3.5处理中的真菌群落结构与SF中pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5和pH 7.5处理的真菌群落结构有显著差异（图S6）。同样，pH 3.5处理中的细菌群落结构也与SF中的其他pH处理显著不同（图S6）。ANOSIM分析表明，在SC中，不同pH处理的真菌群落结构差异显著（ANOSIM统计r=0.68，P<0.01）。PCoA分析显示，pH 3.5和pH 7.5处理的真菌群落结构与pH 4.5、pH 5.5和pH 6.5处理的真菌群落结构有显著差异（图S7）。五种pH处理的细菌群落结构差异很大（图S7），ANOSIM分析结果证实了这一点（ANOSIM统计r=0.94，P<0.01）经过30天的pH调节，在SF和SC中真菌（图4）和细菌群落（图S8）在属到科水平上发生显著变化。在SF中，SIMPER分析显示，Phialocephala、Mortiella、Geminibasidium分别贡献了各pH处理间真菌群落的Bray-Curtis总差异的6%，5%和1%（表S4）。土壤酸化显著降低了Mortierella、Trichoderma、Geminibasidium的相对丰度（P<0.05），同时显著增加了Phialocephala的丰度（P<0.05）。Chloridium和Penicillium只在ph3.5、ph4.5、ph6.5和ph7.5处理中出现，尽管它们在真菌群落中所占比例很低。Indicator分析还表明，在pH6.5和pH7.5处理中，Penicillium是最丰富的属（表S5）。根据SC的SIMPER分析，真菌属Exophiala排名第一，占各pH处理间Bray-Curtis总差异的8%，其次是Ceratobasidium（2%）、Acidomelania（2%）、Tararomyces（2%）、Chaetomium（2%）、Coniochaeta（1%）、Articulospora（1%）和Mortierella (1%)（表S6）。在SC中，Exophiala最为丰富，其在ph4.5和ph5.5处理中所占比例均大于50%（图4）。SC中Mortierella的丰度随土壤酸化而降低，这与SF一致（图4）。此外Ceratobasidium、Acidomelania、Talaromyces仅在酸性土壤（pH 3.5、pH 4.5、pH 5.5）中大量存在（图4），这与Indicator分析（表S7）一致。

土壤初级异养硝化速率与¹⁵ N-NO₃^-产生及微生物丰度的关系

在SF和SC中，在¹⁵N-NH₄⁺（P <0.01）和¹⁵N-甘氨酸（P <0.05）处理中，初级异养硝化率与异养¹⁵ N-NO₃^-产量对总¹⁵ N-NO₃^-产量的贡献呈显著正相关（图5）。在¹⁵N-NH₄⁺（r=0.40，P<0.05）和¹⁵N-甘氨酸（r=0.55，P<0.05）处理中，土壤真菌数量与初级异养硝化速率（r=0.88，P<0.01）以及异养¹⁵ N-NO₃^-产生对总¹⁵ N-NO₃^-的贡献呈显著正相关。此外，真菌/细菌的比值与土壤初级异养硝化速率呈显著正相关（r=0.83，P<0.01），在¹⁵N-NH₄⁺（r=0.46，P<0.05）和¹⁵N-甘氨酸（r=0.55，P<0.01）处理中也表现出显著的正相关。土壤细菌数量与土壤异养硝化作用和异养NO₃^-产生率无显著相关性（P>0.05）。就真菌属而言，在土壤中，Phialocephala（r=0.98，P<0.01）、Chloridium (r = 0.91, P < 0.05) 和Tararomyces (r = 0.86, P < 0.05)的相对丰度也与SF和SC土壤初级异养硝化速率呈显著正相关。