Protein & Cell：TCF-1缺失会影响肠道微生物群的组成，并增加对结肠炎的易感性

发稿时间：2021-01-11来源：天昊生物

肠道微生物群的多样性和组成对于维持与哺乳动物健康相关的宿主共生细菌的内环境稳态起着关键作用。微生物群落紊乱与多种人类疾病的发病机制有关，如自身免疫性疾病、过敏、糖尿病、肥胖症和炎症性肠病（IBD），这显然与患者和小鼠模型的肠道失调有关。近年来，免疫基因与宿主共生菌之间的相互作用以及宿主-菌群的共生机制引起了广泛的研究兴趣。肠道相关淋巴组织（GALTs）包括肠粘膜周围的各种免疫细胞、肠粘膜派尔集合淋巴结（PPs）和肠系膜淋巴结（MLNs），是肠道免疫的关键。越来越多的研究表明，免疫基因通过与肠道相关淋巴组织（GALTs）缺失相关的先天性和适应性免疫臂来影响微生物群组成的稳定。Toll样受体5通过介导REG3γ的产生，对鞭毛细菌的定殖起关键作用。先天性衔接子MyD88的缺失损害了T卵泡辅助细胞（Tfh）和产生IgA的B细胞的发育，导致生发中心反应缺失而无法控制细菌群落。抑制性共受体程序性细胞死亡-1（PD-1）缺失导致肠粘膜派尔集合淋巴结（PPs）生发中心产生IgA的B细胞受损，造成微生物群落组成失衡。总之，GALTs免疫调节基因的缺失导致生发中心反应受损和IgA表达水平降低，这与肠道细菌群落失衡有关。众所周知，转录因子TCF-1（由Tcf7编码）在T细胞、NK细胞和ILCs的不同发育阶段发挥重要作用，这些免疫亚群对于建立GALT和维持肠道相关免疫的平衡至关重要。新的研究表明，TCF-1在调节Tfh细胞的分化中也起着关键作用，Tfh细胞是帮助生发中心B细胞产生抗体的关键T细胞群。尽管TCF-1的这些重要功能已被阐明，但TCF-1与肠道细菌组成的关系仍不清楚。在这项研究中，我们的目的是破译TCF-1在肠道微生物群落的稳态和炎症中的作用。

鉴于TCF-1对GALTs的重要性，我们首先检测了TCF-1缺失小鼠(Tcf7^−/− mice)和同窝对照小鼠的肠粘膜派尔集合淋巴结（PPs）和肠系膜淋巴结（MLNs）。与之前的报道类似，TCF-1缺失小鼠(Tcf7^−/− mice)由于发育异常而表现出不可见的PPs（图1A），以及细胞数量减少的较小的MLN（图1B）。下一步我们重点研究MLN中产生IgA的B细胞亚群。在TCF-1缺失的MLN中PNA⁺Fas⁺生发中心B细胞（GCBs）的频率和细胞数显著减少（图S1）。尽管在Tcf7^−/−小鼠中，CD138⁺CD19^lo浆细胞（PCs）的频率在统计学上不显著（图S1C），但细胞数量显著减少（图S1D）。Tcf7^−/−小鼠粪便上清液中的IgA水平显著降低（图1C），相应地检测到Tcf7^−/−小鼠肠道内容物的IgA结合微生物群显著减少（图1D）。这些数据表明，TCF-1的缺失导致MLNs中GCBs和PCs减少，IgA水平降低，这与肠道中IgA结合细菌的减少密切相关。这些数据表明，TCF-1的缺失导致MLNs中GCBs和PCs减少，IgA水平降低，这与肠道中IgA结合细菌的减少密切相关。

为了确定TCF-1的丢失是否影响细菌入侵过程中IgA的产生，我们用李斯特菌感染模型检测了生发中心反应。在感染后第7天，对来自Tcf7^−/−小鼠和同窝对照小鼠的Tfh和GCB细胞进行分析，我们发现Tcf7^−/−小鼠的SPs和MLN中SLAM ^loCXCR5⁺Tfh细胞的频率和数量显著减少（图S2A），Tcf7^−/−小鼠中的PD-1 ^hiCXCR5⁺GC Tfh细胞也表现出显著减少（图S2B）。同时，来自Tcf7^−/−小鼠的SP和MLN中的PNA⁺Fas⁺GCB在actA⁻LM-Ova激发下显著减少（图S2C），因此，与对照组相比，Tcf7^−/−小鼠的SPs和MLN中CD138⁺CD19 ^loPC的频率和数量也低得多（图S2D）。免疫组化分析进一步证实了Tcf7^−/−小鼠SP和MLN的B细胞滤泡内受损的PNA⁺GCs（图S2E），结果，在没有TCF-1的情况下，粪便中抗原特异性IgA和IgG的水平显著降低（图S2F）。总之，这些结果表明TCF-1对Tfh细胞的分化以及在急性细菌感染时产生抗原特异性IgA的生发中心反应是必需的。

考虑到年龄是建立稳定肠道细菌组成的关键因素，选择5、10和22周龄的小鼠进行16S扩增子测序分析。通过加权Unifrac距离的主坐标分析（PCoA），发现不同年龄的Tcf7^−/−小鼠的微生物群落都明显不同于其同窝对照组（图1E）。5周龄和22周龄Tcf7^−/−小鼠的微生物多样性明显减少，然而在10周龄的Tcf7^−/−小鼠中，没有统计学差异，尽管也表现出类似的趋势（图S3A）。与同窝对照组相比，Tcf7^−/−小鼠的微生物群落中具有较多的Bacteroidetes和较少的Firmicutes（图1F）。我们进一步利用LEfSe分析在对照组和Tcf7^−/−小鼠中发现了几个差异丰富的分支，例如，Tcf7^−/−小鼠的促炎细菌（包括Prevotellaceae、Akkermansia、Enterococcus）水平升高，健康细菌（如Lactobacillus、Bifidobacterium）水平降低（图S3B和S3C）。此外，Tcf7^−/−小鼠10周龄组在属水平上，Bacteroides（在拟杆菌门中占优势）增加，10周龄组和22周龄组在纲水平上，Bacilli（在厚壁菌门中占优势）减少（图1G）。为了检测分类群的协同效应，分别使用5周龄、10周龄和22周龄组的数据分析了对照组和Tcf7^−/−小鼠之间富集OTU的丰度相关网络，正如预期的那样，对照样品中富集的OTU与Tcf7^−/−小鼠富集的OTU呈负相关，这反映了Tcf7^−/−小鼠肠道内容物中菌群的全部改变。同时，对照组或Tcf7^−/−小鼠体内富集的OTU显示出正相关（图S3D）。我们的结果还表明，对照组和Tcf7^−/−小鼠之间复杂性的改变与年龄有关。

为了评估基于肠道微生物群落多样性变化的功能效应，使用16S扩增子测序数据进行KEGG途径分析。22周龄组比5周龄或10周龄组有更多不同的途径，特别是那些与免疫和感染相关的途径，例如，在10周龄和22周龄的Tcf7^-/-小鼠和对照组之间，传染病的传播途径（PATH：ko09171）明显不同，而在5周龄时则没有。我们的结果表明，随着年龄的增长，这些显著的差异在不同的途径中逐渐表现出来（图S3E），一个可能的原因是宿主和微生物群在不同的遗传环境中长期相互作用，建立了不同肠道微生物群组成的稳态；另一方面，与年轻小鼠相比，老年小鼠的肠道功能有所下降，包括消化、营养吸收和免疫活性，这些综合因素在老年TCF-1缺失组和对照组之间积累了更多的差异，这些发现为阐明不同年龄阶段遗传缺失宿主肠道菌群组成提供了新的思路。为了探索由于TCF-1缺失而引起的肠道菌群失衡和肠道炎症之间的相关性，我们用抗生素预处理的野生型小鼠从不同供体接收粪便建立了诱导性结肠炎模型，如流程图所示（图2A）。作为对照，我们首先通过硫酸葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导了Tcf7^-/-小鼠或共同饲养的对照组的结肠炎模型，结果发现Tcf7^-/-小鼠在DSS激发下表现出比其同居对照表现出更多的体重减轻和更严重的肠道炎症（图2B和2C，左图）。与先前的研究一致，这些结果表明TCF-1缺失导致结肠炎的加重，然而，这些严重的结肠炎症状并不仅仅源于肠道失调，因为肠道炎症与多种复杂因素有关。随后，用抗生素预处理的野生型小鼠建立诱导性结肠炎模型，这些小鼠接受来自22周龄Tcf7^−/−小鼠或共同饲养的对照组老鼠的粪便微生物群。我们发现，接受Tcf7^-/-小鼠粪便的老鼠在DSS激发下比接受共同饲养的对照组粪便的老鼠体重减轻更多，症状更严重（图2B和2C，右图），接受Tcf7^-/-小鼠粪便的老鼠的结肠比对照小鼠短（图2D和2E），因此，接受Tcf7-/--小鼠粪便微生物群的受体小鼠表现出更多的隐窝结构丢失和破坏性组织损伤（图2F和2G）。这些数据表明，与对照组相比，接受Tcf7^−/−小鼠粪便微生物群的受体小鼠发生了更严重的结肠炎症，并且TCF-1缺失导致的肠道微生物群失调是DSS激发增强肠道炎症的一个不可或缺的因素。

总之，使用不同年龄阶段的Tcf7^−/−小鼠来评估TCF-1在肠道微生物群中的作用，并且16S rRNA扩增子测序数据反映了Tcf7^−/−小鼠肠道细菌群落组成的紊乱。与同窝对照组相比，TCF-1缺失小鼠的PPs不明显，MLN变小，与生发中心反应缺失相关的GCB减少，从而导致IgA产生缺失和IgA结合细菌减少。因此，Tcf7^−/−小鼠肠道细菌群落的失调与年龄有关，并有助于促进结肠炎症。因此，我们的结果揭示了以前未知的TCF-1在维持肠道菌群内稳态中的作用，并证明TCF-1缺失是导致肠道炎症的一个危险因素，对临床试验具有潜在的意义。