【昊阅读】甲基化芯片组学筛查后，到底怎么验证？

发稿时间：2021-01-21来源：天昊生物

相信不少研究表观遗传学的小伙伴在进行甲基化组学芯片筛查后，都面临一个艰难选择，到底选什么位点去验证呢？

其实很多已发表文章都为大家提供了答案。今天小编就来带大家读读几篇甲基化研究文章（部分是天昊客户的文章），看看候选位点的筛选有哪些策略可以让我们参考。

英文题目：Genome-wide DNA methylation analysis in systemic sclerosis revealshypomethylation of interferon-associated genes in CD4+ and CD8+ T cells

中文题目：全基因组DNA甲基化研究发现系统性硬化症患者CD4+ 和CD8+ T细胞的干扰素相关基因表现低甲基化状态

期刊名：《J Invest Dermatol.》    

发表时间：2017年12月05日    

影响因子：7.143

单位：上海复旦大学生科院王久存教授课题组

研究方法：

                    

甲基化候选位点的筛选方式

    1）针对芯片检测获得的差异甲基化位点，进行通路富集分析，发现type I IFN signaling pathway 在2种细胞类型中都显著富集: CD4⁺ (P = 7.59 × 10^-6); CD8⁺ (P = 2.10 × 10^-8)

2）在通路中基于P值和基因功能，筛选了16个基因，对对应的62个差异甲基化位点进行大样本验证。

3）基于这62个差异甲基化位点进行目标区域扩增和目的区域甲基化二代测序（天昊Methyltarget检测）大样本验证，其中57个位点成功被检测，同时二代测序又获得了周围154个CpG位点的甲基化数据。验证成功的位点集中在5个IFN相关基因。

4）因为有57个位点既采取了芯片检测，又进行了基于二代测序的Methyltarget验证，因此针对overlap样本进行了技术一致性分析，R2值达到0.88.

5）针对5个验证成功的基因进行甲基化-mRNA表达水平验证，基因的甲基化水平为基因上所有CpG甲基化水平的第一主成分。

6） 针对5个验证成功的基因，进行甲基化、表达与血清 type I IFN-a/b 蛋白水平的关联分析

英文题目：Rheumatoid arthritis–associated DNA methylation sites in peripheral blood mononuclear cells

中文题目：外周血单核细胞中类风湿性关节炎相关的DNA甲基化位点

期刊名：《Annals of the Rheumatic Diseases》    

发表时间：2017年12月05日   

 影响因子：16.102

单位：苏州大学

• 甲基化候选位点的筛选方式

1）甲基化芯片共鉴定了1046 个差异甲基化位点 (DMPs) (|Δβ|>0.05 + p<0.05), 其中730 个DMPs 位于598个基因。

2）在这598个基因中，445个基因 (覆盖 540 DMPs) 有表达数据。相关性分析得出，有107个DMP和 91个基因的表达水平存在相关性 (p<0.05) (正相关:负相关=44:63). 其中的67个基因 (覆盖81DMPs)在组间存在差异表达(p<0.05)。

3）针对上文提到的445个DMGs,，分别进行基于STRING的蛋白互作分析，在91个 DMGs 和67 个 DMGs 的互作分析结果中，都检测到了interferon-inducible gene interaction subnetwork这一网络（下图A）. 进一步基于Cytoscape，针对81个DMPs和67个相应的基因mRNA的表达数据进行共表达整合网络分析，确定了5个亚网络（其中b4，b5同时包括了甲基化和表达数据）。基于这部分分析，鉴定了几个hub gene：MX1, IFI44L, DTX3L and PARP9。

4）基于上述结果，选择10个DMGs：PARP9, IFI44L, MX1, ISG15, FAM8A1, STK17A, BLK, CNPY1, CBX7and SLC7A14 进行差异甲基化和差异表达的独立样本验证。选择条件为：(ⅰ) DMP位于启动子, (ⅱ) DMP的甲基化水平与基因表达水平显著相关, (ⅲ) DMP 上下游300bp的CpG位点丰富 (如：目标区域至少有3个CpG位点), (ⅳ) 基因属于通路分析中鉴定出来的优先选择.

5）针对10个DMG，共检测了15个DNA片段(100–300 bp) 。5个在独立样本验证成功的DMPs ，有三个位于PARP9基因(cg00959259, cg08122652, cg22930808) 。10个基因在独立样本中，有6个存在差异表达，其中4个基因和发现阶段趋势也一致（BLK, IFI44L, MX1 and PARP9) 。

6）后续选定PARP9基因进行后面的功能验证。

Nat Commun (IF: 12.121). 2017 Feb 1;8:14053. doi:10.1038/ncomms14053.HOPX Hypermethylation Promotes Metastasis via Activating SNAIL Transcription in Nasopharyngeal Carcinoma

• 甲基化候选位点的筛选方式

1）确定差异DMP和关注的基因： P<0.05 and Δβ change ≥|0.2|。只选择转录因子启动子区(TSS and 5′-UTR)的CpG位点进行分析，TFs的查询网站 (http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/)2）在344 TFs 中确定1,984 个差异CpG sites。其中 HOPX (cg21899596) 为甲基化水平改变最大的cpg位点。

2）在344 TFs 中确定1,984 个差异CpG sites。其中 HOPX (cg21899596) 为甲基化水平改变最大的cpg位点。

3）独立样本验证HOPX 基因启动子区的CpG岛区甲基化情况（下图为验证区域），确定HOPX 基因启动子在癌组织和癌症细胞系中都高甲基化。

4）  验证表达水平和HOPX 基因启动子区甲基化的相关性。

5） HOPX 基因的功能研究。

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