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【昊文章】上海六院最新研究成果发现Paget's骨病新致病基因!

发稿时间:2021-04-02来源:天昊生物



Paget’s骨病(PDB)是一种慢性进展性代谢骨病,以破骨细胞的异常激活为特征,导致骨吸收增加和代偿性骨形成、骨硬化。PDB能够影响骨骼的某个或多个区域,伴有多种临床表现,包括骨痛、骨骼和关节畸形、病理性骨折、耳鸣、听力下降以及视力丧失等。

骨肿瘤是PDB最严重的并发症,其中最常见类型为骨肉瘤,发生率为1%,其风险增加是普通人群的数千倍。其次还可并发纤维肉瘤、软骨肉瘤以及骨巨细胞瘤(Giant Cell TumorGCT),其中合并GCT非常罕见,并且这一疾病的发病机理仍不明确。

遗传是PDB发病的重要因素之一,报道发现SQSTM1TNFRSF11ATNFRSF11BVCPHNRNPA2B1等基因的突变与PDB相关。ZNF687曾被报道与意大利南部几例PDB/GCT患者有关,然而,PDBPDB/GCT的分子机制仍未完全解析,上述的已知基因只能解释其中一小部分病例。

课题组于2017年和2019年分别收集到两个早发型PDBGCTPDB/GCT)家系样本,其中家系一包含祖孙三代24位成员,10位成员以常染色体显性方式被诊断为PDB(图1,诊断资料详见原文),所有的患者呈现出PDB多骨侵犯(至少3个部位骨骼受累),并且发病年龄呈早发型。家系二包括母子两代4位成员,先证者和其母亲以常染色体显性方式被诊断为PDB(诊断资料详见原文)。这项研究同时纳入了30PDB散发患者,这些患者均未检测出与PDB相关的已知基因突变。研究另外招募了570名健康汉族人群志愿者作为对照,检测健康人群中的突变频率。



为了发现PDB/GCT的致病基因,研究人员对家系一15位成员进行连锁分析,并对患病的6位成员(II-2II-4II-5II-9III-4III-9)进行全外显子组(WES)测序。多点参数连锁分析在染色体178547-5657423LOD分数最高,为2.70(图2A)。研究通过WES鉴定出73个功能变异,但只有2个在关键连锁区域内。进一步通过Sanger测序发现只有1个与疾病表型显示出精确的共分离:PFN1基因的c.318_321delTGAC杂合突变(p. Asp107Argfs*3),编码Profilin 1蛋白,该基因位于染色体17p13(图2B)。该突变位点4bp的缺失会导致一个提前终止密码子的移码突变,形成一个由108个氨基酸而不是140个残基组成的蛋白。研究人员又利用Sanger测序在1例散发患者中发现了PFN1基因的另一个相邻位置的缺失突变(图2B),c.324_324delG杂合突变(p.T109Rfs*2)。而在家系二成员(I-2)中鉴定到PFN1c.335 T > C错义突变(p.Leu112Pro,图2B),这些研究结果表明PFN1的截短型突变和错义突变均是PDB/GCT的致病突变,而在健康对照中并未发现以上类型的突变。



接下来研究人员在113例单纯GCT患者的肿瘤样本中分析PFN1基因是否存在体细胞突变,结果并未检测出PFN1体细胞突变存在。为了验证患者的破骨细胞是否具有典型的Pagetic破骨细胞特征,研究人员分别从健康对照和患者(家系一III-9)的外周血中分离出单个核细胞,并将其向破骨细胞诱导分化。正如预期,研究人员观察到PFN1突变的PDB患者破骨细胞数量及大小远高于对照组(图3)。



为了研究PFN1突变在PDB发病机制中的功能,利用CRISPR-Cas9技术构建了Pfn1突变小鼠,Pfn1 c.318–321缺失纯合突变对于小鼠胚胎形成是致死的,Pfn1+/mut小鼠与野生型(WT)小鼠相比,突变小鼠从出生到成年,体型较野生型更小,体长和股骨长度缩短,颅面骨和脊柱表型明显差异(图4A)。MicoCT 3D重建显示与WT小鼠相比,Pfn1+/mut小鼠的颅缝较宽,颅面骨和脊柱后凸畸形(图4B)。另外,Pfn1+/mut小鼠骨小梁参数显示较WT骨量明显减少(图4C)。




为了进一步评估Pfn1突变是否影响破骨细胞分化,分离WTPfn1+/mut小鼠骨髓巨噬细胞,诱导其分化成破骨细胞。研究发现,Pfn1+/mut小鼠的破骨细胞数量显著高于WT小鼠 (图5A, C)。

此外,吸收陷窝形成实验显示,来自Pfn1+/mut小鼠的破骨细胞形成的吸收陷窝更大、更深,骨吸收能力更强(图5B)。这表明该突变导致破骨细胞的骨吸收活性明显增强,这与PDB患者活跃的骨吸收表型一致。

骨转换标志物反映骨形成和骨吸收的活性。通过ELISA检测了P1NPTRACP-5b的表达水平,结果显示与WT小鼠相比,Pfn1+/mut小鼠的P1NPTRACP-5b均显著升高(图5D),表明Pfn1+/mut小鼠骨转换活跃。这也与PDB患者骨吸收活性增强相一致。




另外,采用HE染色比较8周龄小鼠股骨远端骨组织差异,发现与WT小鼠相比,Pfn1+/mut小鼠的骨小梁数量减少且结构紊乱(图6A)。随后,研究人员利用TRAPPfn1+/mut小鼠和WT小鼠破骨细胞进行染色,在Pfn1+/mut小鼠干骺端检测到大量的多核TRAP阳性细胞,而在WT小鼠中破骨细胞数量很少(图6B)。接着利用免疫组化染色评估Profilin 1在骨组织中的表达情况,结果显示:与WT小鼠相比Pfn1+/mut小鼠的Profilin 1蛋白表达显著降低(图6C),这与Profilin 1的截短突变导致编码蛋白功能丧失一致。



综上,这项研究报告了PFN1基因的三种不同突变,包括两种截短突变和一种错义突变。上述突变位点导致了早发型PDB/GCT严重的临床表型。建立的Pfn1基因截短突变的小鼠模型表现出PDB样骨表型,证实了Profilin 1蛋白功能缺失可能通过激活NF-κB通路,导致PDB/GCT发生。在本研究中,证实Pfn1截短突变小鼠为研究PDB相关病理机制的理想模型,将极大地帮助我们在未来揭示人类早发型PDB的病因和病理机制。同时这项研究也拓展了PDB的致病基因谱。PFN1基因突变的鉴定对于鉴别PDB中易发生GCT的个体具有重要诊断价值,此外PFN1突变导致PDB/GCT的确切分子机制还有待进一步研究。


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