【昊文章】郑树森院士团队最新成果：GNA14高甲基化及其在HCC中的抑癌作用！

发稿时间：2021-04-02来源：天昊生物

一、数据分析发现GNA14作为HCC潜在甲基化相关的肿瘤抑制基因

为了获得HCC最重要的潜在肿瘤抑制基因，作者分析了TCGA和GSE94660中的mRNA表达数据及TCGA的DNA甲基化数据。从TCGA甲基化数据中获得了535个差异甲基化基因（图1A），TCGA表达数据中获取了1088个在HCC肿瘤组织中显著下调的基因（图1B）。对三个数据集取交集发现了两个重叠的基因GNA14和TBX15（图1C），GNA14表现出DNA甲基化水平上调（图1D），而mRNA表达下调（图1E），并且与HCC患者预后呈负相关，而TBX15并未显示出这一结果。因此，选定GNA14作为HCC的研究对象。

二、GNA14在HCC中表达显著下调

为了确定GNA14在HCC中的表达，利用qRT-PCR对收集的临床配对样本进行表达定量验证，结果发现GNA14 mRNA表达在肿瘤组织中显著下调（图2A-B）。此外，多株HCC细胞系表现出GNA14 mRNA表达水平更低（图2C）。多个配对样本和细胞系的GNA14蛋白水平同样显著更低（图2D-E）。ROC曲线分析GNA14在诊断TCGA数据库（AUC = 0.948）和本院HCC（AUC = 0.935）中表现出较好的灵敏度和特异性（图2F）。免疫组化显示与匹配的正常组织相比，肿瘤组织中GNA14表达降低（图2G）。此外，GNA14的表达与临床特征相关，在本院HCC标本中，HBV感染组织（4.55倍）和血管侵袭组织（2.63倍）中GNA14 mRNA表达显著下调。在低分化组织（4.6倍）和复发患者组织（6.47倍）中，GNA14表达也显著降低（图2H）。

三、HCC中GNA14启动子呈高甲基化

为了探究GNA14在TCGA中的甲基化状态，使用Shiny methylation Analysis Resource Tool (SMART)进行分析。结果发现GNA14的三个探针（ch9.991104F，cg12687527和cg17301902）在肿瘤组织中显示出甲基化上调（图3A）。另外TCGA数据显示GNA14甲基化水平和mRNA水平呈负相关（图3B），而且GNA14高甲基化与HCC预后差相关（图3C）。利用METHPRIMER（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）分析GNA14启动子区域发现两个明显的CpG岛，对12对HCC样本检测这两个CpG岛的甲基化水平，通过DNA甲基化测序发现其中一个CpG岛（基因组区域80262823-80262968）在肿瘤中呈高甲基化（图3D）。GNA14 mRNA表达水平与DNA甲基化测序区域的甲基化水平同样呈现显著负相关（图3E）。肝癌细胞株（SK-Hep-1，HCCLM3，Hep3B和PLC/PRF/5）和正常肝细胞株（L02，HepLi5）也用于甲基化水平检测。甲基化测序结果显示，与正常肝细胞相比HCC细胞甲基化状态上调，特别是在SK-Hep-1、Hep-3B和PLC/PRF/5细胞中（图3F）。ChIP-qPCR分析显示，在SK-Hep-1和Hep3B细胞中，DNMT1和DNMT3A与GNA14启动子区结合（图3G）。在SK-Hep-1细胞中敲除DNMT1和DNMT3A后，甲基化测序显示CpG岛甲基化水平下调（图3H），而GNA14蛋白表达升高（图3I）。用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷刺激肝癌细胞系（SK-Hep-1，PLC/PRF/5，Hep3B，HCCLM3，HepG2和Huh7）48h后，除HCCLM3外，GNA14 mRNA水平均显著升高（图3J）。DNA甲基化测序结果显示，5-氮杂胞苷处理的肝癌细胞系（SK-Hep-1, Hep3B）的DNA甲基化水平显著下调（图3K）。总结以上结果可以发现肿瘤中GNA14表达的下调可能是由于其启动子区DNA甲基化水平上调所致。

四、HBV编码的X蛋白（HBx）引起GNA14启动子高甲基化

TCGA数据库显示，HBV感染患者GNA14 mRNA水平更低（图4A）。因此，检测了10例HBV感染患者和10例未感染患者肿瘤组织中GNA14蛋白水平，发现HBV感染患者的GNA14水平较低。另外HBV阳性的HCC组织GNA14水平低于正常组织，而HBV阴性的HCC组织GNA14水平不显著（图4B）。此外，SMART分析TCGA甲基化数据库发现GNA14启动子（ch9.991104F，cg12687527，cg17301902）的甲基化水平与HBV感染相关（图4C）。HepG2.2.15是一种来源于HBV基因组DNA感染HepG2后的HCC细胞系。与HepG2相比，HepG2.2.15中DNMT1和DNMT3A的蛋白和mRNA表达量显著升高，而GNA14的蛋白和mRNA表达量下降（图4D）。HBx已被证实通过影响DNMTs来调控DNA甲基化，作者使用Co-IP验证HBx与DNMT之间的关系，确认HBx与DNMT1、DNMT3A存在物理相互作用。而HBx与GNA14之间无相互作用。敲低HBx后降低了HepG2.2.15细胞中DNMT1和DNMT3A的表达，但上调了GNA14的表达（图4D-E）。将HBx过表达质粒转染HepG2细胞，观察到HBx过表达组DNMT1、DNMT3A上调，而GNA14下调（图4D）。转染HBx过表达质粒后，用RNA干扰敲除DNMT1或DNMT3A可挽救GNA14的表达。同时敲除DNMT1和DNMT3A显著增加了GNA14的表达（图4D）。双荧光素酶报告系统进一步探索了HepG2、HepG2.2.15、HCCLM3和L02细胞中GNA14启动子活性的变化（图4F）。除了野生型GNA14启动子荧光素酶报告基因系统（wt）外，还构建了甲基化靶点缺失的突变型GNA14启动子荧光素酶报告基因系统（mut，图4F）。在wt组中，与HepG2细胞相比，HepG2.2.15细胞中的启动子活性显著下调（图4G，左图）。但当目标甲基化位点发生缺失突变时，两种细胞系之间的差异消失了（图4G，右图）。当HBx在HepG2、HCCLM3和L02中过表达时，GNA14启动子活性下调，但当目标甲基化位点发生突变时，活性可以恢复（图4H）。作者还用siRNA敲除HepG2.2.15细胞中的HBx、DNMT1和DNMT3A。在相应的敲除组中，GNA14启动子的活性显著升高。然而，当靶DNA甲基化位点发生缺失突变时，GNA14启动子的活性变化被消除（图4I）。综上所述，HBx通过调控DNMT1和DNMT3A，影响GNA14启动子的DNA甲基化，导致GNA14表达下调。

五、GNA14抑制HCC增殖和转移

为了研究GNA14在HCC中的功能，研究人员首先利用HCC细胞系研究对细胞增殖的影响，结果发现GNA14过表达显著抑制细胞活性，并且增加了G0/G1期细胞比例，降低了S期细胞比例，同时GNA14过表达降低了克隆形成的数量。进一步研究GNA14对肿瘤生长的影响，GNA14过表达组的人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制，肿瘤大小和肿瘤显著降低。作者在研究中观察到GNA14和Notch1存在共定位的现象，因而，进一步通过实验证实了GNA14通过促进Notch1切割抑制了HCC增殖（图5）。

分析GNA14对肿瘤转移的影响，发现过表达GNA14显著抑制HCC细胞迁移和侵袭，小鼠体内实验同样表明GNA14过表达与HCC转移减少相关。JMJD6蛋白可能与GNA14存在相互作用，免疫荧光实验进一步证实了GNA14和JMJD6共定位于HCC细胞的细胞质和细胞膜。GNA14抑制HCC转移的作用可能通过抑制JMJD6的表达来实现（图6）。