【昊阅读】移植前和移植后连续暴露于疾病相关的肠道微生物能够促进野生型小鼠的超急性移植物抗宿主病

发稿时间：2021-09-02来源：天昊生物

英文题目：Continuous pre- and post-transplant exposure to a disease-associated gut microbiome promotes hyper-acute graft-versus-host disease in wild-type mice

中文题目：移植前后持续暴露于疾病相关肠道微生物能够促进野生型小鼠的超急性移植物抗宿主病

期刊名：GUT MICROBES

影响因子：10.243 (一区Top)

发表时间：2020年7月

研究目的：肠道微生物在异体造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的发展中起着关键作用。在这里，我们使用一个小鼠模型来研究移植前和移植后肠道微生物群对急性GVHD的个体贡献。实验方法：将野生型小鼠与对超急性GVHD敏感的IL-17RA-/-小鼠共同饲养。粪便样本是从移植前后的WT和IL-17RA-/-小鼠中收集的，并使用宏基因组测序分析微生物组。实验结果：仅通过移植前共同饲养来引发野生型小鼠不足以加速GVHD，然而，仅在移植后共同饲养的WT小鼠中观察到疾病的加速。当小鼠在移植前后连续共同饲养时，引发和恶化的效果是相加的，导致WT小鼠的疾病加速比仅在移植后共同饲养看到的更快。微生物组的宏基因组分析显示移植前相同宿主与Muribaculaceae科中尚未培养的细菌菌属内特定的两个菌种CAG-485和CAG-873的转移有关。移植后，我们观察到Enterobacteriaceae中的Escherichia coli和Enterobacter hormaechei subsp. steigerwaltii与GVHD发展相关。这种超急性GVHD与迟发性疾病(>移植后10天)相关的肠道微生物明显不同。研究结论：这些结果阐明了移植前后肠道微生物在移植后对于急性GVHD易感性疾病的重要性，并证明这种联系具有细菌物种的特异性。

移植物抗宿主病(GVHD)是造血干细胞移植的一种严重并发症，发生率为30–50%。这种疾病的特征是T细胞介导的目标器官组织损伤，包括皮肤、肝脏和胃肠道。事实上，在包含T细胞的非相关干细胞移植中，几乎所有急性GVHD的致命病例都与胃肠道有关，3-4期肠道GVHD发病后2年的总存活率为25%。在实验证明无菌和抗生素治疗的小鼠疾病严重程度降低后，肠道微生物群最初被认为是肠道GVHD发展的关键因素。移植前给予调理方案以消融免疫系统对于成功移植是必要的，然而，这些治疗导致的组织损伤允许微生物和微生物产物的移位(例如，脂多糖)从胃肠腔进入循环，触发炎性细胞因子TNF、IL-1和IL-6的释放，这种病原体相关分子模式和炎性细胞因子的体循环导致宿主抗原呈递细胞的激活，随后引发分化和供体T细胞的扩增，以及导致靶组织破坏的压倒性免疫反应。抗生素治疗形成了一些调理方案，旨在绕过这一过程，然而，对抗菌药物耐药性的担忧意味着这种做法并不普遍。对人类和动物健康至关重要的共生微生物系统的破坏也可能对移植受体施加进一步的压力，从而潜在地影响恢复。有趣的是，我们最近证明了肠道微生物群在影响肠上皮细胞导致GVHD启动的MHC II类表现中的关键作用。因此，有必要增加我们对肠道微生物群在调节肠道GVHD发展中的精确作用的理解，以期设计更有针对性的预防或治疗策略。

对肠道微生物在GVHD中的作用的研究很复杂，因为在GVHD发生之前和同时观察到微生物的波动。在患病时，小鼠和人类肠道内的细菌多样性随着组成的巨大变化而减少。肠杆菌科、乳杆菌科和肠球菌科的细菌成员都显示出随着疾病的发展而丰富度增加，通常在整个群落中占主导地位。移植时患者肠道微生物多样性的减少，但在GVHD开始之前，与疾病死亡率的增加有关，特别是，Blautia物种丰度的降低与人类GVHD有关。急性GVHD的发展与移植前患者体内厚壁菌门丰度的增加以及整体多样性水平的降低有关，表明移植前肠道微生物的组成也可能起作用。了解肠道微生物在GVHD的发展中是否有一个决定性的时期，对于充分阐明这种关系的性质至关重要。

我们最近在GVHD小鼠模型中观察到粪便微生物与超急性GVHD发展之间的关联。在研究了IL-17RA-/-小鼠中的独特微生物群落(移植后持续发展超急性GVHD的小鼠基因型)后，发现通过与IL-17RA-/-小鼠共同饲养，可在WT小鼠中诱发加速相关疾病。共同饲养前后的粪便微生物群分析显示，群落成员主要来自IL-11。然而，由于小鼠在整个实验过程中被共同饲养，尚不清楚移植前共同饲养是否足以诱发加速疾病，或者移植后共同饲养是否也有助于这一结果。为了确定是否有一个基本的共居期，进而确定微生物的基本转移，我们用移植前或移植后单独共居的小鼠进行了额外的实验。这些数据表明，持续暴露于IL-17受体缺陷小鼠的疾病相关微生物菌群对于在WT小鼠中最大程度诱导超急性GVHD是必要的。移植后共同饲养仅导致移植后疾病进展率介于非共同饲养WT对照组和连续共同饲养WT小鼠之间。仅在移植前共同饲养不足以显著加速疾病。因此，移植前启动的有害效应只有在移植后暴露于IL-17RA-/-小鼠时才能实现。

小鼠和异体干细胞移植

野生型C57BL/6小鼠(本文称为野生型WT)购自动物资源中心。采用C57BL/6背景的IL-17RA-/-小鼠进行内部繁殖。动物程序采用QIMR伯格霍夫动物伦理委员会批准的协议对小鼠进行移植和监测。简而言之，受体小鼠接受1000 cGy的全身照射。重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以10 mg剂量皮下注射给供体小鼠6天。小鼠移植25 × 10⁶个T细胞或20 × 10⁶个T细胞衰竭(TCD)的G-CSF的脾细胞。所有移植的小鼠都被安置在灭菌的微型隔离笼中，并接受酸化高压灭菌水。使用已建立的评分系统评估GVHD，并根据机构指南处死临床评分≥6的小鼠。来自连续共同饲养实验(图1a)的数据已经在以前发表过。

宏基因组数据处理、组装和MAG分析

使用BWA v0.7.12，以小家鼠基因组(GRCm38.p5)作为参考基因组，最小30个碱基的比对长度和最大15个剪切碱基的读序被认为是小鼠来源的。使用metaSPAdes v3.12.0来独立组装每个样本中的非小鼠读序。Binning分析通过使用BamM v1.7.3 (https://github.com/ecogenomics/BamM)来将六个样本的子集读序映射到每个结果来组装的，使用MetaBAT v2.12.1对最小长度为2000个碱基的contig来进行恢复。使用CheckM v1.0.12评估生成的bin的污染程度和完整性，使用dRep v2.2.3以95%的最小二级平均核苷酸同一性(-sa 0.95)取消完整性> 75%和污染< 7%的bin。使用GTDB-Tk v0.3.0和基因组分类数据库(GTDB)版本04-RS89确定得到的MAGs的分类隶属关系。

宏基因组群落图谱

使用最小种子长度为25的BamM，将每个样品的读序映射到GTDB 03-RS86版(> 80%完整，< 7%污染)的16,958个细菌和古细菌基因组的去重复集合(dRep，95%)中。使用Mosdepth v0.2.3测定的基因组> 1x覆盖范围> 1%和总覆盖范围0.01X的基因组被保留，并与回收的一组去重复的MAG结合，用于评估群落组成。最终的237个基因组包括从这项研究中回收的95个MAG，加上来自NCBI的142个基因组。通过使用BamM对最小种子长度为25个碱基进行比对并随后过滤最小百分比同一性为95%来确定每个样品的最终基因组组的读序计数。每个基因组读序计数被计算以说明基因组大小，同时保持每个样本的原始未映射读序百分比作为对多样性的反映。相对丰度是使用比例读序计数作为每个样品的总非宿主读序的一部分来计算的。α多样性使用QIIME v1.8.0计算，计数使用R包DESeq2 v1.20.0.中实现的大小因子方法进行标准化，MAGs使用Prokka v1.12.进行注释

功能注释

MAGs原始读序和预测蛋白质的功能注释通过与HMMER v3.1b2比对隐藏马尔可夫模型数据库dbCAN CAZy v6 Pfam r32和TIGRFAM v15 (仅MAGs)进行，最大e值截止值为1e-10。KEGG矫正是通过BLAST v2.8.1与2017年7月下载的UniProt UniRef数据库的比对确定的，最大e值为1e-10，随后提取相关的KO术语。

Muribaculaceae MAG分析

基于120个单拷贝标记基因的比对，使用恢复的MAGs加上公开可得的基因组构建了Muribaculaceae基因组树。使用IQ-TREE v1.6.9 (100个重复，非参数)的LG+C10 + F + G模型推断自举最大似然树，后验平均位点频率≥50%序列(38,690个位置)内残基的比对位置。使用e值截止1e-6的Proteinortho v5.16b鉴定直向同源蛋白质。基因树是使用在恢复的Muribaculaceae MAGs和GTDB版本03-RS86中鉴定的同源物构建的，由GeneTreeTK v0. 0 .14 (https://github.com/dparks1134/GeneTreeTk)使用默认设置。自举最大似然树(100个重复，非参数)使用IQ-TREE v1.6.9构建，ModelFinder用于模型选择。最小相似度为30%的比对位点用于系统发育推断。ARB用于排列过滤和树的优化。

大肠杆菌MAG分析

通过对比VFDB核心数据库对恢复的MAGs和公共基因组进行BLAST搜索，对入库和未入库大肠杆菌重叠群中的毒力因子进行预测，最大e值截止1e-10，最小比对同一性为30%，最小比对分数为70%。毒力因子类别从VFDB VFanalyzer下载的参考基因组中获得。使用CD-HIT命令，以具有99%的同一性(-c 0.99)和90%的较短序列覆盖率(-aS 0.9)阈值对所有小鼠未结合重叠群进行聚类。通过对NCBI nt数据库的BLAST搜索，确定了与大肠杆菌同源的代表性重叠群，最大e值阈值为1e-10，然后过滤含有“大肠杆菌”的序列描述，最小比对同一性为97%，最小比对分数为查询重叠群的50%。使用上述相同的方法从SRA实验SRR3340629、SRR5050584、SRR5050585和SRR5050587中得到额外的大肠杆菌MAG。

统计分析和图形表示

使用Kaplan-Meier估计绘制存活曲线，并通过对数秩分析进行比较。Wilcoxon秩和检验用于α多样性值的统计分析，利用Benjamini-Hochberg调整进行多重比较。P <0.05被认为具有统计学意义。点图表示为平均值的平均标准误差。使用R package vegan v 2.5-1对数据进行主成分分析，使用metagenomeSeq v1.22.0.对对数累积和标度(log-CSS)进行标准化。使用DESeq2 v1.20.0中的Wald检验，基于总的注释读序计数或每个基因组的读序计数，对样本组之间的细菌分类群和功能注释的差异丰度进行评估，并使用Benjamini-Hochberg调整进行多重比较。P <0.001被认为具有统计学意义。sPLS-DA分析使用R包mixOmics v6.3.2进行，使用中心对数比转换的相对丰度值(伪计数1e-07)和50xM倍交叉验证(移植前WT的5倍，移植后WT的3倍)。使用EnrichM v0.5.0 (https://github.com/geronimp/enrichM)和Fisher精确检验对与早发和迟发性GVHD相关的MAGs中的功能注释进行比较，Fisher精确检验用于比较与每种疾病类型相关的每个功能类别(即每个单独的CAZy、KO或Pfam分类)的MAGs编码/非编码数量(使用Benjamini-Hochberg调整进行多重比较)。Spearman的rho使用R软件包psych v1.8.12中的“corr.test”函数计算，使用中心对数比率转换的相对丰度值进行多重比较的Benjamini-Hochberg调整。过滤最小相对丰度≥0.05%的细菌家族。p值< 0.05被认为具有统计学意义。热图使用R包pheatmap v1.0.10制作，箱图使用R包ggplot2 v2.2.1制作，点图等利用GGally v1.4.0和GraphPad Prism v8.0.1 (GraphPad软件)制作。

与异常微生物的共处对WT小鼠在急性GVHD的发展中起到引发和加重作用

为了确定暴露于IL-17受体缺陷小鼠的微生物是否有一个关键时期能够在WT小鼠中诱导加速GVHD，我们比较了涉及连续共同饲养小鼠(I)、仅移植前小鼠(II)或仅移植后小鼠(III)的移植结果(图1a)。我们之前公布了实验1的存活曲线和基于16S rRNA的分析，并且在本研究中使用了已公布实验的DNA进行宏基因组分析。我们假设移植前共同饲养为WT肠道群落的病原体置换和疾病做好准备，并且移植后共同饲养通过暴露于高病原体负荷而加剧疾病进展。仅在移植前共饲养小鼠(II)导致总存活时间减少，然而，与单独饲养的WT小鼠没有显著差异(中位存活时间分别为33天和45天；P =0.3605)(图1b)。仅在移植后共饲养小鼠(III)更有害，与单独饲养的WT小鼠相比，所有WT小鼠都死于疾病，总体疾病率显著加快(中位生存期28天对45天；P =0.0015)(图1b)。然而，与连续共同饲养的WT小鼠相比，与移植后共同饲养(III)相关的WT小鼠的疾病恶化显著延迟(中位生存期28天对9天；P =0.0057)(图1b)。虽然连续共同饲养的WT小鼠(I)在移植后4天开始死于疾病，但移植后但未在移植前进行共同饲养的存活的WT小鼠至少存活了23天。我们认为疾病启动的这种滞后可归因于移植前WT小鼠缺乏微生物组依赖性启动。因此，虽然移植前共同饲养的启动效应不足以在隔离状态下加速疾病，但当与移植后恶化结合时，与仅移植后共同饲养的WT小鼠相比，启动小鼠对加速GVHD明显更敏感。

为了获得转移微生物的物种级别分辨率以及它们的功能潜力，我们对每个共同饲养场景的一个实验复制的粪便样本进行了宏基因组测序，包括之前通过16S rRNA扩增子测序分析的连续共同饲养小鼠。对来自在移植前和移植后以及共同饲养前相同小鼠的样本进行了测序。还在移植前和移植后来自单独饲养的(对照)小鼠进行了分析。为了评估细菌群落组成，我们首先进行了基因组恢复，产生了一组代表15个细菌家族的95个元基因组组装基因组(MAGs)。对这些MAGs和一组可公开获得的基因组的读序比对证实了疾病的发展与细菌群落的实质性转变有关。不管共同饲养治疗如何，WT和IL-17RA-/-小鼠的疾病相关微生物组的组成是可区分的。排序分析表明，与连续共同饲养的小鼠相比，WT和IL-17RA-/-小鼠之间的疾病相关肠道群落存在更广泛的差异。在移植后的WT小鼠中，连续共同饲养也与群落多样性的显著降低相关，而当共同饲养仅发生在移植前或移植后时，群落多样性没有显著降低。这些数据表明，移植前或移植后共同饲养的WT小鼠比连续共同饲养的WT小鼠经历了与疾病发作相关的转变，这与在这些小鼠中观察到的延迟疾病表型一致(图1)。

图1、连续共同饲养加速移植后WT小鼠的GVHD。

在组成水平上，在实验一和实验二的WT小鼠中，来自Muribaculaceae (以前未培养的谱系S24-722)的五个细菌物种在共同饲养期间增加(图2)。这些物种在共同饲养的WT小鼠中也明显多于单独饲养的WT小鼠。在两个实验中，在共同饲养过程中唯一被富集的non-Muribaculaceae物种是Prevotella sp002933775。然而，该物种的平均共居后丰度显著低于Muribaculaceae物种(0.3%对1.7%)。我们还对来自所有三个实验的所有移植前小鼠进行了更广泛的分析，并确定了典型易感移植后早发性GVHD的小鼠(IL-17RA -/-和移植前共同饲养的WT小鼠)和典型表现出迟发性疾病的小鼠(单独饲养的WT小鼠)之间的不同微生物组组成(图2b)。与每种疾病类型相关的MAGs的比较没有揭示Pfam、KEGG和CAZy数据库之间的任何显著功能差异，进一步支持启动效应发生在这些功能类别的水平之下或可能由表达的变化驱动。对所有移植前WT小鼠的多变量分析也揭示了非共同饲养和共同饲养WT小鼠之间的区别(图2d)。Muribaculaceae物种一直被认为是这种划分和区分早发和迟发疾病的关键(图2c)。这些发现与我们之前对移植前和移植后共居的WT小鼠进行的16S rRNA基因测序分析的结果一致，该分析将Muribaculaceae家族的成员确定为通过共居改变相对丰度的优势分类群。在富集的Muribaculaceae物种中，四个是CAG-873属的成员，一个是CAG-485属的成员，这两个属目前都缺乏培养的代表。在移植前共同饲养过程中耗尽的Muribaculaceae物种也属于CAG-873属(GVHD27)，这表明启动效应必须至少是物种特异性的。两种(CAG-485 sp。GVHD19和CAG-873 sp。GVHD29)显示了相对丰度模式；在共同饲养实验期间，两者在WT小鼠中持续增加，并且在疾病发作后在WT小鼠中也观察到。

图2、Muribaculaceae的物种在共同饲养期间能够转移并与疾病易感性相关。

与不良微生物持续共存促进了Enterobacteriaceae相关疾病的爆发

由于与GVHD发病相关的肠道微生物组组成发生了很大的变化，我们最初在细菌家族水平上比较了每组WT小鼠的疾病相关微生物组与移植前的组成。无论何时共同饲养发生，Enterobacteriaceae在共宿主的WT小鼠中显著富集，连续共同饲养与该科的显著富集相关(图3)。在物种水平上，在所有三种共同饲养情况下，WT小鼠移植后Enterobacteriaceae丰度显著增加的大部分是Escherichia coli 。因此，持续共同饲养可能会通过Enterobacteriaceae物种的扩大而促进急性疾病，超过小鼠在替代共同饲养情况下所经历的情况。

图3、Enterobacteriaceae细菌数量的增加与疾病有关。

移植后存活率与微生物组成有关

在所有三种共同饲养情况下，我们记录了移植后WT小鼠的一系列存活时间；一些小鼠迅速死于GVHD，类似于IL-17RA缺陷小鼠，而另一些小鼠超过一个月没有发病(图1)。利用移植后存活长度的这种分布，我们确定了Enterobacteriaceae的丰度与移植后WT小鼠的存活之间的负相关，以及Muribaculaceae的丰度与存活之间的正相关(图4a)。这些趋势在基因组水平上也是可以观察到的。随后，我们根据移植后存活时间的可观察聚集性，定义了三种疾病类型进行进一步比较：高度急性(存活≤10天)、中度(存活20–35天)和延迟(存活45+天)(图4a)。排序分析表明，具有超急性疾病(WT和IL-17RA–/–)的微生物组组成与具有中度或延迟疾病发作的微生物组组成之间存在差异(图4b和c)。超急性GVHD与E. coli和B. vulgatus的显著高丰度相关(图4d，表S21)。中度或延迟性疾病与Muribaculaceae和Lachnospiraceae的丰度较高有关。

图4、移植后的存活时间与微生物组成的改变有关。

在这里，我们研究了移植前和移植后肠道微生物群对超急性GVHD发展的影响。我们观察到在移植前从IL-17RA-/-小鼠到WT小鼠的共同饲养过程中，细菌Muribaculaceae成员的转移，以及移植后与疾病相关的Enterobacteriaceae成员的增加。连续共同饲养与Enterobacteriaceae的增加有关，包括E. coli和E. hormaechei subsp. steigerwaltii。我们的结果证明了特定物种与疾病结果的关联，利用粪菌移植FMT等方法促进细菌多样性可能是减少干细胞移植后急性GVHD发展的更成功策略。

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