综述速递 | 宿主-肠道微生物菌群相互作用代谢调节中关键物种的鉴定

表1、人类肠道微生物组中突出的重点分类群的部分列表

除了微生物菌群分类之外，对微生物菌群功能影响的见解还来自宏基因组分析、与组学数据集的整合，特别是代谢组学和体内验证研究。在这一部分，本文回顾了最近的研究，强调了微生物代谢物和相关途径在控制宿主生理中的关键贡献。在人类肠道微生物菌群的众多代谢活动中，我们重点关注短链脂肪酸(SCFA)、色氨酸和胆固醇衍生的代谢物，以及它们与宿主因子的相互作用，例如组蛋白修饰酶、G蛋白偶联受体、芳香烃受体(AhR)、吲哚胺2，3-双加氧酶1 (IDO1)和色氨酸羟化酶1 (TpH1)在屏障维持、免疫调节和肠-脑轴中的作用。

短链脂肪酸(SCFA)

短链脂肪酸是膳食纤维细菌发酵的主要终产物(也可从蛋白质和多肽中获得，但程度较低)，是肠道微生物生态和宿主生理的重要调节剂。主要的短链脂肪酸是乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。纤维衍生的单糖，如己糖、脱氧己糖和戊糖，被几种细菌代谢酶转化为丙酮酸，然后进一步代谢为乙酰辅酶a、琥珀酸或乳酸，主要供给SCFA生产。乙酸盐来源于乙酰辅酶a，乙酰辅酶a由丙酮酸直接或通过Wood-Ljungdahl途径产生。丁酸盐也是由乙酰辅酶a产生的，但是通过两个乙酰辅酶a分子缩合成乙酰乙酰辅酶a，然后代谢成丁酰辅酶a，再生成丁酸盐。一些肠道细菌也可以将乳酸转化为丁酸。丙酸酯分别来源于丙烯酸酯和琥珀酸酯途径中的乳酸酯或琥珀酸酯。它也可以通过将脱氧己糖转化为固有乙酰辅酶a的丙二醇途径产生。短链脂肪酸在近端结肠中的浓度最高，达到130mmol/kg肠腔内容物。然而，由于粘液层厚和肠蠕动，到达肠细胞的有效浓度可能较低。在短链脂肪酸中，丁酸盐是结肠细胞的重要能量来源，主要在结肠中消耗。丙酸盐和乙酸盐在肝脏中进一步代谢，但考虑到肠道中高浓度的乙酸盐，它是留在体循环中的主要SCFA。尽管如此，丁酸盐和丙酸盐也可以通过激素和神经系统信号间接影响宿主的系统生理。SCFAs可以通过扩散或通过转运蛋白SLC5A8进入细胞，并通过三种报道的机制发挥其作用：(a)通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)对基因表达进行表观遗传控制，例如在肠上皮细胞(IECs)和免疫细胞中，(b)通过作为G蛋白偶联受体(GPCRs)的配体，主要是GPR43和GPR41，也分别称为游离脂肪酸受体2 (FFAR2)和FFAR3，以及GPR109A，也称为烟酸受体1或羟基羧酸受体GPR109A，(c)通过作为AhR激动剂。

由于结肠细胞对丁酸盐的能量依赖，因此SCFA是肠屏障完整性和粘膜免疫稳态的关键调节因子。据报道丁酸盐还可以预防结肠炎相关的结直肠癌，也有报道证明丁酸盐通过增强干细胞再生促进肿瘤发生。从机制上讲，丁酸盐通过肠上皮细胞上的GPR43和GPR109A发出信号，刺激炎症体依赖性IL-18的产生，这是肠上皮完整性所必需的。它还通过抑制(减弱固有层巨噬细胞的炎症信号传导)和树突状细胞分化来保护结肠免受炎症影响，并促进调节性T细胞(Treg)的产生，通过FoxP3基因座的乙酰化(图1)。最近，除了丙酸盐和乙酸盐之外，丁酸盐被证明通过GPR41和HDAC抑制在CD4+ T细胞和先天淋巴细胞(ILC)中诱导IL-22表达；后者能够增强HIF1α与Il22基因启动子的结合。在有利于葡萄糖代谢(沃伯格效应)的癌细胞中，丁酸盐在细胞核中积累，导致高密度脂蛋白胆固醇的有效抑制浓度。因此，丁酸盐可以表观遗传地去调节癌细胞中参与细胞增殖、细胞死亡和分化的关键基因的表达，但不能调节正常的结肠细胞。丙酸盐，而不是乙酸盐，通过HDAC抑制类似地促进这些过程。基于宏基因组学的方法能够确定肠道微生物组的主要丁酸盐生产者为直肠真杆菌、粪肠球菌和大肠杆菌。然而，只有普拉梭菌被正式认定为关键物种(表1)。有趣的是，在另一项使用宏基因组时间序列的研究中，直肠大肠杆菌被确定为一种细菌，受益于脆弱拟杆菌和粪类杆菌等推定的关键物种的存在。

图1、部分微生物代谢物对肠道稳态、粘膜免疫调节和宿主代谢健康影响的示意图。

在新陈代谢中，膳食纤维和短链脂肪酸通常与体重减轻和血糖指数改善有关。例如，在一项试验中报告了胰岛素敏感性的改善，其中个体被给予补充有抗性淀粉的饮食4周。这种有益的效果可以归功于SCFA。在一项随机对照试验中，与菊粉对照组相比，在24周内对超重的成年人施用菊粉丙酸酯可减少体重增加、腹部肥胖和肝脏脂质积聚。同样，超重/肥胖男性结肠输注SCFA混合物(浓度与摄入膳食纤维后达到的浓度相当)会增加脂肪氧化和能量消耗。从机制上讲，短链脂肪酸合成酶可能通过刺激异常肠激素肽YY (PYY)和胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的产生而发挥作用(图1)，如在使用乙酸盐和丙酸盐的人体中或通过肠道糖异生(IGN)发挥作用，其中丙酸盐和丁酸盐均被证明可增强IEC从头合成葡萄糖，通过肠-脑通讯刺激胰岛素敏感性的增加。GPR41通过其在肠神经系统(ENS)神经元和促进能量消耗增加的交感神经元上的表达来介导能量代谢的改善(图1)。

色氨酸代谢

膳食色氨酸的微生物代谢(富含于十字花科绿叶蔬菜，如欧芹、花椰菜、羽衣甘蓝、西兰花等)最近成为微生物菌群调节肠道内环境稳定的重要途径，特别是通过AhR激活。自1992年基因被克隆以来，AhR因其作为环境传感器的作用而备受关注。除了被异生物质激活之外，色氨酸衍生的配体被微生物菌群分解代谢，包括吲哚、吲哚乙酸(IAA)、3-甲基吲哚和色胺等。AhR在不同的肠道细胞类型中表达，包括IECs、免疫细胞，特别是上皮内淋巴细胞(IELs)、先天淋巴细胞(ILC)3、ILC2、Th17、Treg和ENS的神经元。通过这种集体表达，AhR在屏障完整性以及肠道和免疫稳态中发挥生理上至关重要的作用，特别是通过调节IEC紧密连接，IELs的产生和存活，IL-22和IL-10的产生，以及蠕动和微生物菌群密度的调节(图1)。在肠上皮细胞中，AhR最近与杯状细胞分化的调节有关，特别是在防止衰老过程中结肠杯状细胞耗竭方面。这一过程由白细胞介素-10介导，并由AhR诱导以响应微生物来源的吲哚。在这种情况下，似乎不需要参与急性损伤后肠组织修复的白介素-22或ⅰ型干扰素。AhR也以微生物菌群依赖的方式在结肠神经元中表达，这种神经元特异性表达在肠蠕动的控制中是核心，将AhR定位为肠神经回路的连接。总的来说，AhR保护上皮屏障，促进肠道免疫耐受，防止肠道炎症。因此，其活性的调控与炎症和代谢疾病相关，并且该途径的微生物组刺激，特别是通过色氨酸代谢，已经被证明是对抗这些病理的“环境”手段。

除了AhR配体，色氨酸还被代谢成犬尿氨酸和血清素。在犬尿氨酸途径(KP)中，IDO1主要负责将色氨酸转化为犬尿氨酸和下游终产物，包括烟酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、喹啉酸和犬尿氨酸。后者通过在IECs和免疫细胞上表达的GPR35信号发挥免疫调节作用并保护肠道。血清素途径将色氨酸转化为神经递质5-羟色胺(5-HT)，即血清素，通过在肠道肠嗜铬细胞和大脑中表达的特化肠嗜铬细胞中表达的TpH1。虽然构成体内产生的所有血清素的90%的外周5-羟色胺不穿过血脑屏障(BBB)，但它调节几个肠道过程，包括刺激ENS神经元、蠕动和营养吸收。此外，色氨酸和5-羟色胺前体(5-HTP)都穿过血脑屏障，影响中枢血清素对宿主生理的作用。共生微生物菌群在色氨酸向犬尿氨酸和血清素的代谢中起着重要作用。此外，通过SCFA和BA代谢，微生物菌群可以诱导TpH1并刺激5-HT生物合成。肠源性犬尿氨酸和5-羟色胺还与慢性炎症、代谢和神经精神疾病的发病机制有关。

胆固醇和脂质代谢

肠道微生物菌群的胆固醇和脂质代谢是微生物菌群影响宿主生理的另一个方面。一方面，微生物成分，特别是厌氧消化球菌，已被确定为结肠细胞中胆固醇生物合成的诱导剂，由TLR信号下游的SREBP2激活介导，并与结直肠癌患者粪便中这种细菌的升高水平一致。另一方面，微生物将胆固醇代谢成粪甾烷醇(一种吸收不良的甾醇)最近被证明是降低宿主血清胆固醇水平的机制。除了胆固醇，鞘脂的细菌代谢，具有长链氨基醇骨架的脂质，也有助于肠道中的免疫稳态和宿主代谢健康。拟杆菌门的细菌占健康人体肠道微生物菌群的30-40%，由于它们表达丝氨酸棕榈酰转移酶，因此具有合成鞘脂的能力。细菌来源的SL促进肠道中的免疫稳态。值得注意的是，IBD病患者的粪便中含有宿主SL(包括神经酰胺)的标记物，但缺乏保护肠道的细菌源SL。总之，这些表明肠道细菌的胆固醇和脂质代谢显著影响宿主代谢和生理。然而，这些途径仍然知之甚少，需要在进一步的治疗开发之前进行充分的研究。

胆汁酸代谢

近年来，肠道微生物菌群的胆汁酸代谢引起了人们的极大兴趣，因为它们被认为是重要的微生物源代谢物，可调节健康和疾病中的多种重要功能。原发性胆汁酸主要由肝细胞在细胞色素P450 CYP7A1的不可逆7α-羟基化后从胆固醇合成。在人类中，这些是胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)，这些疏水性初级胆汁酸然后通过与甘氨酸和牛磺酸结合而形成两亲性，然后沿着磷脂分泌到胆囊中，形成胆汁，在消化过程中释放到十二指肠中时，胆汁将主要用作去污剂。在小肠中，结合的胆汁酸被微生物胆盐水解酶(BSH)解结合，释放主要通过沿上皮的被动扩散和末端回肠的主动重吸收被重吸收的疏水部分。总的来说，最初胆汁酸池的95%通过这个肠肝循环被重新吸收。然而，5%的胆汁酸逃避重吸收并沿结肠向下行进，在结肠中，它们通过肠道细菌进行进一步的代谢，这导致二级胆汁酸的形成。除了在脂质吸收中的作用外，胆汁酸还具有全身功能，可以调节肝脏能量代谢、脂肪细胞分化和抑制免疫激活。共轭和非共轭胆汁酸都参与了这种宿主-微生物组的相互作用。

胆汁酸与许多慢性疾病有关，包括肥胖、NASH、IBD、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬化)和原发性硬化性胆管炎。有趣的是，一些疾病与胆汁酸的肠道细菌代谢缺陷特别相关，如艰难梭菌感染，这已被证明可以通过恢复肠道微生物BSH活性来纠正。事实上，胆汁酸解偶联释放出对大多数细菌有毒的游离非偶联胆盐，从而作为微生物生态系统的调节剂。因此，这是肠道细菌携带的关键功能之一，对肠道微生物菌群落的组成有显著影响。

鉴于这些发现，恢复肠道携带关键代谢途径的微生物菌群可以打开广泛的治疗前景。特别是，鉴定肠道微生物菌群中携带这些功能的关键物种，可能是开发针对肠道微生物生态系统的未来生物疗法的一个重要步骤。人类微生物组的关键物种通常是使用经验证据来确定的。然而，生物信息学越来越多地被用于识别关键物种，并且已经开发了几种方法来利用下一代测序(NGS)数据。

表征人类肠道微生物组的最常见方法之一是使用粪便样本中标记基因的扩增和测序。最常用的标记基因是用于检测细菌的16S rRNA基因，但偶尔也会使用其他看家基因来捕获细菌多样性。16S rRNA可用于比较不同状态下(如健康与患病、不同食物来源等)属或种水平的微生物丰度，通过将读数分配给按分类标记基因相似性分组的生物集群，称为操作分类单位(OTUs)。然后，评估微生物菌群落之间差异的一种广泛使用的技术是使用UniFrac多样性度量，结合使用主成分分析(PCA)或其衍生物的无监督多元统计。

即使使用粪便样本中的标记基因测序来评估一个属或种在不同组间的存在与否似乎是有希望的，keystone物种定义的一个关键部分是种间相互作用。与疾病关联相关的细菌群落的分级聚类已被广泛用于尝试鉴定重要的细菌分类群。与分类单元存在与否的相关性通常使用诸如Jaccard’s指数这样的指标来确认：在两个物种之间，该指数由两个物种存在的样本数量与测试样本数量之间的比率来定义。该指数的值分别在0和1之间，从无相关性到强相关性。然而，一项关于微生物菌群落建模的广泛研究表明，为评估物种之间的相关性而选择的指标应适应正在研究的特定数据集。值得注意的是，据报道，与皮尔森指数等其他指标相比，Jaccard’s指数在应用于同现网络时具有相对较低的敏感性。因此，即使使用Jaccard’s指数可以可靠地使用分类单元的存在与否来识别相关性，在使用基于网络的方法时，使用Pearson或Spearman索引来评估相关性应该是首选的。

为了克服与基于分类单元的相关性分析相关的问题，这些问题可能由于虚假的关联而导致冲突的结果，值得注意的是，研究者最近提出利用细菌功能群的概念来将宏基因组数据降维为具有生态意义的功能单位。尽管这种方法仍然受到使用相对丰度数据的限制，但它提出了一种有趣的方法来完善基于16S的数据集的数据分析，以识别相关的疾病关联。

需要考虑种间的相互作用来确定群落中的关键物种，这导致了基于网络的新方法的发展。最常见的方法是应用于16S rRNA基因(或其他标记基因)测序或宏基因组数据的共现或共丰度网络。这些网络通常是通过计算每对OTU之间的成对相关系数产生的，但其他方法正在开发中，以建立互动网络。

共生网络已被广泛用于识别关键物种。几个相关指标评估了这些网络的交互性能。有研究者使用广义Lotka-Volterra建模(gLVM)来模拟物种之间的竞争和合作互动。该研究揭示了高平均度(一个节点在网络中的平均边数)、高接近中心度(一个节点到任何其他节点的平均距离)、高传递性和低介数中心度(节点A的介数中心度是一对节点B和C之间通过节点A的最短路径数)可以以85%的准确率预测物种。这些参数产生了高度互连的节点(即梯形物种)，称为“中枢”模式，对应于直接和间接相互作用在一起的多个物种。这使得能够识别依赖于关键物种存在的细菌群落。然而，这种方法的主要缺点是需要时间序列样本，而获取时间序列样本既困难又耗时。此外，仅研究了少数丰富的物种，因此使用该方法鉴定低丰富的关键物种是基本不可能的。其他基于网络的方法，如关联规则挖掘，正被应用于微生物组测序数据，以确定重点物种。简而言之，该方法允许估计一个物种的存在是否是其他物种的存在所必需的。微生物组成员之间的共现网络也可以使用广义增强线性模型(GBLMs)来应用。最近，使用随机矩阵理论(RMT)方法的共现网络被应用于鼠肠道微生物组数据，以识别假定的关键物种。虽然这些方法对于预测假定的关键种是有用的，但是识别这些种所携带的关键功能对于理解关键细菌和它的功能群之间的相互作用是至关重要的。然而，扩增子测序的使用不允许精确鉴定菌株或它们在肠道微生物组中携带的代谢功能，因为OTUs的分配只允许基于参考基因组重建代谢途径，从而导致菌株特异性代谢功能的可能丧失。因此，最近开发了一些方法来克服这些问题，使用宏基因组测序重建菌株特异性代谢途径。

宏基因组学的最新发展为肠道微生物菌群的多样性提供了更清晰的视角，特别是通过允许接触尚未培养的细菌。使用宏基因组组装基因组(MAGs)重建基因组规模的代谢网络和模型(GSMNs)或推断单个基因的功能类别，可以精确预测肠道微生物菌群的代谢能力。这类工具的一个很好的例子是Belcour等人开发的Metage2Metabo算法，该算法能够使用参考基因组和MAGs在生态系统层面分析代谢途径。由于关键物种在肠道生态系统中具有重要的代谢功能，该工具被用于检测推定的关键细菌。为了准确预测群落的代谢能力，将可利用的营养物质和基因组信息(来自参考数据库或宏基因组样本)结合起来，预测能够产生目标代谢化合物的最小细菌群落。在所有预测的最小群落中遇到的细菌被认为是必要的共生体，而在至少一个预测的最小群落中遇到的细菌，但不一定是全部，被认为是替代共生体。此外，与基因组的输入数据集相比，预测的关键物种数量相当少，这可能是由于需要向软件提供初始营养物和目标代谢化合物的非穷举列表，以便预测最小的群落。尽管如此，据我们所知，该工具是第一个专门用于识别复杂微生物菌群落中假定的关键物种及其相关代谢功能的工具。

现代测序技术能够对几乎任何微生物生态系统进行广泛定位。然而，重要的是微生物组数据的质量和我们从中获得的信息高度依赖于原始采样的质量。事实上，环境因素强烈影响适应任何变化的细菌群落，如一天中的时间、温度、酸碱度、食物供应(即肠道微生物菌群的饮食)以及宿主相关微生物菌群的宿主年龄。因此，可以建议重复采样，以说明时间变化并获得细菌生态系统组成的更准确图片。

关于采样的另一个重要考虑是，大多数大型人体研究都集中在容易到达的位置，使用非侵入性工具，例如分析口腔和粪便样本。因此，所分析的微生物菌群很难代表位于肠道深处的内部生态系统。典型地，粪便样本反映了远端结肠的微生物菌群，主要由梭菌属(Clostridiales)占主导地位，而事实表明，肠道微生物菌群沿着胃肠道遵循特定的空间分布，这种分布因区域特异性而变得更加复杂，腔内和粘膜相关物种之间观察到的差异说明了这一点。因此，大多数人类队列研究仅限于远端胃肠道的研究。尽管有这种限制，NGS方法和生物信息学一直有效地支持在肠道微生物组中寻找关键物种。NGS技术的快速改进产生了越来越大的数据集，允许深入表征肠道微生物菌群落，这也要求新的生物信息学工具以更有效和完整的方式分析NGS数据集。

图2、使用下一代测序识别微生物组关键物种的最常用生物信息学策略示意图。红色显示的细菌是在差异分析中从患者粪便中消失的关键物种(左下方)，通过有益的相互作用(“中枢”)(中下方)与其他物种高度相连，或产生促进其他细菌生长的必需代谢物(如SCFAs)(右下方)。

这篇综述讨论了肠道微生物来源的代谢物在肠道稳态、代谢健康、免疫调节和肠脑相互作用中的作用，描述了微生物研究中使用的当前生物信息学工具，并强调了与这些方法中的一些方法相关的弱点，以识别关键物种及其缺失的功能。本综述提供了肠道微生物菌群代谢活动的最新发现和微生物菌群生物信息学分析领域的现状。本文建议，在寻找关键物种的过程中，未来的研究应该考虑样本和数据处理的协调，以及包括年龄、性别、营养和其他环境线索在内的其他变量的整合。提供支持关键物种在调节微生物生态系统中的功能的机械证据也特别重要，例如通过群体感应、交叉摄食、细菌素或通过其他未知机制。此类研究将为设计基于微生物菌群的治疗干预措施以对抗慢性疾病奠定基础，方法是恢复关键物种及其对微生物菌群平衡的有益影响，以支持与其宿主的健康共生互动。

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