祝贺！天昊Accu16S细菌绝对定量助力脱氧海水微生物碳氮循环研究登陆一区《Environment International》

发稿时间：2021-10-17来源：天昊生物

— 昊项目文章—

近期，由厦门大学海洋与地球科学学院、山东大学海洋科学与技术研究所及海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室等单位合作，在国际顶级环境科学与生态学期刊《Environment International》（IF=9.62，一区Top)上发表最新了研究成果。研究者通过使用微生物扩增子测序和宏转录组技术，研究了渤海脱氧海水中微生物群落的结构和转录活性模式，进一步揭示了脱氧环境中微生物介导的碳和氮循环过程。

在本项研究中，天昊生物有幸承担了微生物Accu16S^TM细菌绝对定量测序工作，在恭喜客户取得好成绩的同时，让我们简单看下这篇文章。

英文题目：Transcriptomic evidences for microbial carbon and nitrogen cycles in the deoxygenated seawaters of Bohai Sea

中文题目：渤海脱氧海水中微生物碳氮循环的转录组学证据

期刊名：Environment International

影响因子：9.62 (一区Top)

富营养化引起的水体脱氧在沿海海洋环境中持续发生，并改变群落结构、代谢过程和能量分流，导致对生态环境的重大威胁。中国渤海季节性脱氧事件频发，然而，脱氧如何影响微生物的功能与活性仍不清楚。在这里，我们通过使用Accu16S^TM细菌绝对定量测序和宏转录组方法，研究了脱氧海水中的微生物群落结构和转录活性模式。优势菌是变形菌门Proteobacteria (1.4 × 10⁶拷贝ml^-1)、蓝细菌门Cyanobacteria (3.7 × 10⁵拷贝ml^-1)、拟杆菌门Bacteroidetes (2.7 × 10⁵拷贝ml^-1)和奇古菌门Thaumarchaeota (1.9 × 10⁵拷贝ml^-1)。在各种环境因素中，溶解氧、酸碱度和温度与微生物群落组成和功能活性的相关性最为显著。宏转录组的数据显示，奇古菌在脱氧水中具有较高的转录活性，相关的氨氧化、氨转运和固碳途径的核心基因表达显著增加。参与光合作用和固碳途径的蓝细菌转录本在低氧水域显著减少。与此同时，表层和底层水中核酮糖二磷酸羧化酶编码基因的转录本从光自养生物转变为化能自养生物形式。此外，转录组结果表明异养生物在转运低分子量溶解有机氮中起到了关键作用。微生物抗氧化活性相关转录本丰度的增加对应于低氧海水中奇古菌有氧代谢的增强。总的来说，我们的转录证据显示，在低氧水生环境中，奇古菌尤其是沿海生态型的氨氧化古菌种群显著增加，表明化能自养固碳对碳流动的贡献增强。

过去50年来，海洋中的溶解氧(DO)水平一直在持续下降，预计到本世纪末，全球海洋将损失大约3–4%的溶氧能力。DO的减少将直接威胁水生生态系统中需氧生物的生长和生存，增加生态系统可持续性的压力，降低生物多样性和渔业产量。溶解氧的下降还将限制生态系统能量学，改变生态系统结构，并严重影响微生物介导的碳、氮、磷和微量金属等元素的生物地球化学循环。群落组成和代谢过程的微生物多样性会受到缺氧的显著影响。气候变暖作为已知的海洋脱氧机制之一，直接降低了氧的溶解度，通过强化分层作用减缓了水循环，还促进了微生物呼吸，导致溶解氧浓度降低。营养物质过量排放导致的近岸水体富营养化是缺氧频繁发生的另一个重要驱动因素。持续的养分输入将刺激透光层的初级生产力。生产力的提高将产生更多有机物为异养生物提供燃料，并促进水体和沉积物中的微生物呼吸，消耗大量DO，导致沿海生态系统面临更严重的脱氧环境问题。包括细菌和古菌在内的微生物虽然体积小，但数量非常丰富，总生物量极大，是海洋生态系统中物质和能量流动的主要通道。海洋脱氧将迫使生态系统物质和能量流从高级别的捕食者转向低级别的微生物转变。研究表明，微生物在低氧环境下甚至在缺氧条件下仍然可以有氧生长。大多数关于低氧区的研究主要集中在低氧的形成机制及其对生物元素(如碳、氮和硫)生物地球化学循环的影响。然而，脱氧水中微生物的适应机制和环境调节因子却鲜有研究。功能活动，特别是它们在低氧水域中调节碳和氮循环的作用，仍然不清楚。最近，中国典型的沿海地区，包括长江口、珠江口、黄海和渤海，都经历了季节性缺氧事件，通常在6月至9月观察到低氧或缺氧带。这里，溶解氧浓度介于缺氧的常规定义和氧饱和条件之间的海水被认为是“低氧海水”。利用Accu16S^TM细菌绝对定量和宏转录组技术，我们研究了缺氧渤海优势细菌和古菌的群落组成和转录活性变化。因此，我们将低氧海水中的优势原核生物群及其功能活性与氧饱和环境中的优势原核生物群及其功能活性进行了比较，以在转录水平上揭示脱氧环境中微生物介导的碳和氮循环。

样本采样是在中国渤海两个地点进行的(图1)。根据每个测站的总水深和温跃层，使用附着在电导率-温度-深度(CTD)取样器上的10 L Niskin瓶从表层、中层和底层三个深度采集海水样本(表1)。在船上即时测量溶解氧浓度。本文将低氧海水定义为缺氧(≤2mg·l^-1)至氧饱和状态(≥7mg·l^-1)。然后根据地表水和底水中溶解氧浓度的分布确定低氧区(图1)。地点A31和A45的特点是水文条件相似，但溶解氧浓度不同(图1b和表1)。在代表低氧环境的地点A31和A45表层之下，溶解氧浓度分别为5.11至5.47 mg·l^-1和3.92至3.96 mg·l^-1；而表面在氧气中饱和(图1a和表1)。因此，选择表面层和非表面层的样品进行比较。16S rRNA基因和宏转录组分析的样本是从两个部分获得的。通过尼龙筛网(20 mm)、聚碳酸酯滤膜(3 mm)和聚碳酸酯滤膜(0.22 mm)过滤海水，收集相应粒径的微生物。用于宏转录组分析的样品一式三份，保存在RNA later中。此外，还收集滤液，用于以后的硝酸盐(NO₃-N)、亚硝酸盐(NO₂-N)、铵盐(NH₄-N)、溶解无机磷酸盐(DIP)和溶解硅酸盐(DSi)浓度分析。滤膜储存直到在实验室测量叶绿素a、颗粒有机碳和有机氮的含量。

图1、(a)表层水和(b)底层水中溶解氧的采样点和基于调查的分布。在A45和A31站点观察到底层水中溶解氧浓度最

表1、渤海两个脱氧地点(A31和A45)的环境参数。缩写：DO，溶解氧；Chl a：叶绿素a；DIC：溶解无机碳；DIP：溶解无机磷酸盐；DSi：溶解硅酸盐；DOC：溶解有机碳；POC：颗粒有机碳；PON：颗粒有机氮；TPA：总原核生物丰度。

环境测量中的海水温度、酸碱度和盐度是用CTD探头测量。溶解氧是用温克勒法在船上测量的。溶解氧饱和度(溶解氧%)的计算方法是现场测量的溶解氧浓度除以与大气平衡时的溶解氧浓度。使用高效液相色谱法测量Chl a浓度。根据标准比色方法分析NO₃-N、NO₂-N、DIP和DSi的浓度。使用靛酚蓝分光光度法测量NH₄-N浓度。使用流式细胞仪测量原核生物总丰度。
之后分别提取样本中的微生物群落DNA和RNA，并进行16S rRNA基因的相对和绝对定量测序，以及宏转录组测序，并结合样本分组信息进行生信分析及数据统计。

两个地点的三个采样深度的环境参数如表1所示，数据表明两个研究地点的水文条件相似。按照门和科分类的微生物组成及转录情况如图2所示。16S rRNA基因的高通量测序产生了6918个OTUs，属于45个门，其中变形菌(49.2%)、拟杆菌(10.8%)、丝状菌(5.3%)、放线菌(5.1%)和疣状菌(1.4%)是主要的异养类群(图2a)。作为光自养和化能自养的优势类群，蓝细菌和奇古菌分别占总微生物丰度的15.9%和8.1%(图2a)。上述9个优势门占总相对丰度的95.9%，其余36个门仅占4.1%。从表层水到底层水，藻的相对比例显著增加(p < 0.01)，而蓝细菌的相对比例显著降低(p < 0.01，图3a)。

图2、A31和A45位点自由生活(0.2-3.0 mm)和颗粒相关(3.0-20 mm)原核生物群落的微生物组成柱状图，包括门(a-c)和科(e-f)分类。相对16S rRNA基因序列数据(a和d)、绝对定量16S rRNA基因序列数据(b和e)和转录本分类(c和f)反映了表层、中层和底层微生物组成的动态变化。

图3、表层和底层低氧区海水中优势菌群的变化。

16S rRNA基因的绝对定量总共鉴定了45个门。地表水的总丰度高于底层，这与流式细胞仪测量的原核生物总丰度的趋势一致(表1)。优势门主要包括变形菌(平均值，1.4 × 10⁶拷贝ml^-1)、蓝细菌(3.7 × 10⁵拷贝ml^-1)、拟杆菌(2.7 × 10⁵拷贝ml^-1)、疣孢菌(1.9 × 10⁵拷贝ml^-1)、放线菌(1.5 × 10⁵拷贝ml^-1)、普朗克菌(5.5 × 10⁴拷贝ml^-1)、疣孢菌(2.4 × 10³拷贝ml^-1)、硝基菌在这些优势门中，变形菌门、蓝细菌门和奇古菌门分别占总丰度的54.7%、14.9%和7.6%。包括变形菌和蓝细菌在内的优势细菌的绝对丰度都随着水深的增加而降低，而奇古菌门、硝化刺菌门和硝化螺旋菌门则呈现出相反的分布模式(图3b)。深度和溶解氧浓度对优势门的多样性没有显著影响(图3b)。在系统发育科水平上它们的相对和绝对丰度没有随着氧浓度的降低而显著变化。

在测量的环境因素中，溶解氧、酸碱度、温度、水深、DIN、DIP和DSi浓度在调节渤海低氧水域微生物群的组成和转录活性方面起着重要作用。奇古菌门、硝化刺菌门和硝化螺旋菌门的转录活性与DO、pH和温度呈显著负相关，而蓝细菌的转录活性与这三个因素呈正相关(图4)。此外，奇古菌和蓝细菌的转录活性分别与水深呈正相关和负相关(图4)，间接暗示DO和光对微生物分布的调节。奇古菌的转录本与NH₄-N浓度呈负相关，硝化刺菌和硝化螺旋菌的转录本与NO₃-N浓度呈正相关(Mantel的r > 0.5，p < 0.001，图4)。这些相关性直接表明转录本的功能组成也受到DIN浓度的显著影响。

图4、缺氧海洋微生物群落组成的环境驱动因素。热图显示了环境因素和优势微生物群之间的比较，颜色梯度表示Spearman’s相关系数。分类(绝对和相对丰度)和转录功能群落组成与每个环境因子相关通过Mantel partial检验。边缘宽度对应于对应距离相关性的Mantel’s r统计量，边缘颜色表示基于9,999个排列的统计显著性。

转录分析揭示了缺氧渤海海水中三种主要的微生物生活方式：(a)光自养，(b)化能自养和(c)异养。根据直向同源群(COGs)簇的分析，来自奇古菌和蓝细菌的转录本显示出在“能量产生和转化”中最大的分布。因此，我们主要关注不同微生物的氮代谢和固碳途径。氮代谢表现为氨的运输和同化。氮代谢途径的关键转录本，如amoABC和nirK随着深水中DO浓度的降低而显著增加(图5a)。对于碳固定，奇古菌中3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环(3-HP/4-HB循环)的转录本增加，但蓝细菌中卡尔文(CBB)循环的转录本在低氧水域中减少(图5b)。相反，各种转运蛋白编码基因的转录本，包括ATP结合盒(ABC)转运蛋白、TonB依赖转运蛋白(TBDT)和DON转运蛋白编码基因(尤其是那些参与氨基酸、肽、核苷和维生素转运的基因)的转录本，在低DO水环境的异养细菌中显示出高丰度(图6)。相对于与颗粒附着的微生物，自由生活的微生物表达更高的转运蛋白相关转录本。自由生活群落中转录本的总表达量在表层水中最高，而颗粒附着群落中转录本的总表达量则呈相反的趋势，底层水中转录本的总表达量较高(图6)。在底层观察到与奇古菌抗氧化能力在低DO浓度下具有更高水平的转录本，如超氧化物歧化酶和低效的过氧化氢清除编码基因，无论自由生活态还是与颗粒附着态的生活方式(图7)。

图5、在自由生活态和颗粒附着态的奇古菌中核心编码基因的转录本丰度，涉及脱氧沿海海水中的(a)氮和(b)碳代谢。

图6、近岸脱氧海水中优势微生物群落的转运体的转录本丰度。

图7、近海脱氧海水中优势类群的抗氧化编码基因的转录本丰度。

本研究在脱氧水中观察到奇古菌的高转录活性，其中氨氧化、氨转运和碳固定途径的核心基因的表达显著增加。同时，蓝细菌的转录本(特别是光合作用和固碳途径)显著减少。在低溶解氧浓度的底层水中，RuBisCO的转录本从光合自养转变为化能自养方式。此外，异养细菌的转录本表明异养生物在转化低分子量DON中起主要作用。抗氧化编码基因转录本的升高对应了低氧海水中奇古菌有氧代谢活性的增强。总的来说，本研究的结果表明，奇古菌尤其是氨氧化的沿海生态型，对低氧水生环境有很强的适应能力，并进行化能自养固碳，对脱氧环境下的碳流动具有很大贡献。

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