近日，来自天昊生物客户的研究成果在《Frontiers in Nutrition》（IF = 6.576）上成功发表。该研究利用Accu16S®细菌绝对定量测序专利技术，深入探讨了中药天芪平颤颗粒（TPG）对帕金森病(PD)治疗的有效性和潜在作用机制，证实了TPG在调节肠道菌群和炎症反应中的作用。
英文题目：Network Pharmacology and Absolute Bacterial Quantification-Combined Approach to Explore the Mechanism of Tianqi Pingchan Granule Against 6-OHDA-Induced Parkinson’s Disease in Rats
中文题目：利用网络药理学与细菌绝对定量相结合的方法探讨天芪平颤颗粒抗6-OHDA诱发大鼠帕金森病的作用机制
期刊名：Frontiers in Nutrition
发表时间：2022年5月6日
影响因子：6.576
帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，其病症表现为运动迟缓、静止性震颤、肌强直和胃肠功能障碍，例如便秘等。天芪平颤颗粒（TPG）是临床上治疗PD的有效中药方剂。然而，TPG在PD治疗中作用机制仍不清楚。
本研究通过网络药理学和大鼠体内实验相结合的方法，揭示了TPG治疗PD的机制，详细技术路线如图1所示。
研究首先利用网络药理学分析方法，通过TPG的药理信息检索自中药数据库与分析平台（TCMSP），进行了化合物分析和疾病靶点鉴定。在网络构建时，使用了来自Therapeutic Target Database（TTD）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、GeneCards和DrugBank数据库的PD差异表达基因数据，并使用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，还进行了GO和KEGG通路富集分析，最后通过人工整合了参与PD发病机制直接相关的通路。
之后，研究利用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注入成年雄性大鼠右前脑中束来建立PD大鼠模型。所有大鼠随机分为三组（每组n = 4只大鼠）Sham组、PD组和TPG组。TPG组大鼠每天同时灌胃TPG（5.6 g/kg）一次。假手术Sham对照组大鼠和PD组大鼠单独灌胃无菌生理盐水。收集所有大鼠最后一次治疗后第二天的粪便，放入无菌EP管中后储存在-80ºC，之后送上海天昊生物公司进行Accu16S®细菌绝对定量测序检测。此外，还利用大鼠的血液样本，通过ELISA实验分析了血清炎性细胞因子的浓度，并利用免疫组化实验，观察了大鼠脑组织中小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生的情况。
在TPG有效成分分析中，研究者在对TCMSP数据库的初步搜索后，确定了73种潜在相关的活性成分。最后选择63种成分作为候选生物活性成分进行进一步分析。在靶点的鉴定中，对63种活性化合物的基因靶点检索后得到1,542个靶点。去掉重叠部分后，最终确定了235个 TPG靶点，此外利用TTD、OMIM、GeneCards和DrugBank 数据库识别767个PD相关靶基因。
图2A为药物靶基因和疾病相关基因维恩图，一共得到了99个重叠靶基因。使用Cytoscape构建了“TPG-Targets-PD”网络（图2B）。具有最高程度中心性(DC)的前五种化合物是槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇和7- O-甲基异木糖醛醇。为了深入探索上述靶点之间的相互作用，研究者构建了PPI网络（图2C）。
图2、TPG治疗的帕金森病靶点筛选。(A)药物靶点和疾病靶点维恩图。(B)TPG治疗帕金森病复合靶点网络。蓝色表示药物-疾病交叉靶点，其他颜色表示TPG的活性化合物，粉红色表示TPG的重叠活性化合物。(C)TPG中帕金森病相关靶点PPI网络。(D)从(C)中提取的TPG中帕金森病相关目标的核心PPI网络。
之后还利用Metascape对99个重叠的TPG和PD目标的GO和KEGG途径进行功能富集。KEGG分析显示，许多靶基因与NF-κB信号通路和T细胞受体信号通路密切相关。GO分析结果发现，相互作用靶点主要与对脂多糖反应及其介导的信号通路、分泌的调节、炎症反应、TNF反应和神经胶质细胞的发育有关。
TPG引起的肠道菌群变化
利用Accu16S®细菌绝对定量测序，首先分析了肠道菌群的多样性变化。与PD组(E)大鼠相比，Sham组(D)大鼠和TPG组(F)大鼠的Chao1和ACE的α多样性指数往往较低（图3A、B），而Shannon指数更高，但三组间无显着差异，提示样本数量有待扩大。
为了进一步分析三组肠道菌群组成的异同，研究进行了样本聚类树分析。值得注意的是，从图3D可以清楚地看到，样本按分组聚集，表明PD组的微生物组成与Sham组和TPG组微生物组成不同。此外，β多样性指数的非度量多维尺度方法（NMDS）和主坐标分析（PCoA）分析，也有类似的结果（图4E，F)，可以发现TPG组和Sham组的差异不明显，说明TPG对照组和Sham组的肠道菌群组成相似。
图3、肠道菌群多样性变化（n=4只/组）：（A-C）三组的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数；(D)样本聚类树分析；（E）NMDS分析。(F) PCoA分析。（原文图4）
图4、差异微生物物种的LEfSe分析。（原文图5）
从纲分类水平分析，发现与Sham组相比，PD组中Negativicutes的丰度显著下降，而Mollicutes则显著增加。而TPG组中Negativicutes又明显高于PD组大鼠（图5A-C）。在目分类水平，与Sham组大鼠相比，PD组大鼠中观察到Selenomonadales的减少，和Enterobacteriales与Mycoplasmatales的增加（图6D-F）。随着TPG的处理，Selenomonadales和Aeromonadales的丰度增加。此外，三组之间的肠道微生物在科（图6G）、属（图6H ）和物种（图6I）水平也有明显差异。这些数据表明PD大鼠肠道微生物失调，TPG可以调节微生物群组成以改善PD大鼠的肠道微生物失调。
图5、大鼠肠道菌群组成差异（n = 4只/组）：（A-C）在纲水平的绝对丰度差异；(D-F)在目水平上的绝对丰度差异；(G-I)在科、属和种水平上的绝对丰度差异。（原文图6）
鉴于肠道微生物菌群失调与功能变化密切相关，研究者还进行了肠道菌群的功能预测分析（图6）。可以看出，与PD组相比，TPG组黄酮类生物合成相关的功能显著上调。越来越多的科学证据表明，类黄酮具有抗炎特性。
之后，研究者探讨了TPG对受损纹状体神经炎症的影响。研究发现TPG可以减轻炎症反应，正如预期的那样，与PD组相比，TPG组的血清外周炎性细胞因子显著降低。此外，免疫组化IHC数据显示，6-OHDA可显著增加PD组大鼠Iba-1和GFAP的表达。TPG给药在很大程度上抑制了PD大鼠黑质中小胶质细胞和星形胶质细胞的活性。
本研究对TPG的网络药理学分析，鉴定了与PD相关的73个化合物和235个靶基因。根据通路富集分析及16S rRNA测序结合的方法，验证了TPG可以改善肠道菌群，抑制PD的炎症反应，成功揭示了TPG在抗PD中的作用机制。
天昊生物微生物扩增子测序相关链接：
喜讯！天昊Accu16S细菌绝对定量技术助力客户股骨头坏死研究登陆Science子刊《Science Advances》；
祝贺！天昊Accu16S细菌绝对定量测序项目登陆顶级环境杂志《Journal of Hazardous Materials》；
又一篇！天昊Accu16S细菌绝对定量测序项目文章登陆国际顶级环境工程杂志《Bioresource Technology》；
祝贺！天昊Accu16S细菌绝对定量助力脱氧海水微生物碳氮循环研究登陆一区《Environment International》；
喜讯！天昊生物16S扩增子绝对定量测序项目文章再次登陆《Science of the Total Environment》
天昊16S扩增子绝对定量测序项目新文：三种双歧杆菌共生关系导致双歧杆菌在含有唾液酸化免疫球蛋白G的人类肠道菌群体外发酵中数量增加；
天昊16S扩增子绝对定量测序项目新文：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子通过改善肠道失调和减轻炎症来保护小鼠免受肝细胞癌侵害；
创新基因科技，成就科学梦想
咨询沟通请联系
18964693703（微信同号）
苏州工业园区星湖街218号生物纳米园C13楼501单元
86(0)512-6295 9990
86(0)512-6295 9995
