J Environ Manage. | 天昊专利技术Accu16S细菌绝对定量测序在生物膜净水研究领域取得新进展

发稿时间：2022-07-19来源：天昊生物

天昊生物专利技术--Accu16S^®细菌绝对定量测序在环境生物膜领域再有新突破！近期，来自北京工业大学的科研人员在《Journal of Environmental Management》上发表论文。该研究利用天昊Accu16S^®细菌绝对定量测序专利技术，深入探讨了蓄水池生物膜的水质净化功能和机理。

英文题目：Storage tank as a pretreatment unit for rainwater cleaner production: Role of biofilm bacterial communities and functional genera in water quality improvement

中文题目：作为雨水清洁生产预处理单元的蓄水池：生物膜细菌群落和功能菌属在水质改善中的作用

期刊名：Journal of Environmental Management

发表时间：2022年

影响因子：8.910

随着城市化进程的迅速推进，传统水源的短缺已成为中国的首要问题，雨水收集近年来也再次受到关注。储水罐是雨水清洁生产过程的初始单元。长期使用后，生物膜将不可避免地在罐壁上形成，定期清洁和/或雨水箱的消毒被认为是消除生物膜负面影响的有效管理和维护策略。能否利用蓄水单元的生物功能实现初步水质改善，将有效降低后续处理单元的负荷，这对雨水清洁生产工艺的设计、优化和管理无疑具有重要意义。

生物膜的生成是一个动态的过程，伴随着微生物群落的变化。近年来，许多研究关注附着在管壁上的生物膜群落，证实了它们在去除水中污染物方面的重要作用。然而，雨水储罐中生物膜群落的动态及其与水质的关系在很大程度上是未知的。水力停留时间（HRT）在塑造微生物群落中起着重要作用，据报道，延长的水力停留时间可以提高一些微生物群落的多样性和微污染物生物降解效率。然而，作为雨水储罐的关键参数，HRT对生物膜细菌群落的影响仍然知之甚少。分析雨水储罐中各种细菌类群之间的相互作用，对于更好地了解不同细菌属协同去除污染物的机制具有重要意义。

微生物群落中的功能性微生物对水质改善做出了巨大贡献。在废水处理领域，功能菌得到了广泛的研究，其中大部分属于优势门，主要分为氨氧化微生物（AOMs）、亚硝酸盐氧化菌（NOB）、反硝化菌（DNB）和有机降解菌(ODB)等几类。然而，人们对它们在贫营养环境中的分布知之甚少，功能分类群与环境因素之间的联系仍不清楚。除氮过程包含多种生物过程，例如 AOM 进行的硝化作用和DNB催化的反硝化作用。已经在许多环境中鉴定和研究了多种参与氮转化的功能基因，以推断氮代谢途径，包括人工湿地、污水处理厂和土壤等。然而，在雨水储存罐中探索氮去除机制的研究仍然不多。

为了填补上述知识空白，研究者系统地探讨了雨水储罐中生物膜的净水功能和机理。具体而言，本研究的主要目的是：1）研究雨水储罐的自净功能以及HRT对其的影响；2）全面分析生物膜细菌群落组成；3）确定与污染物去除和氮代谢相关的功能菌途径；4）探索细菌群落与环境因素之间的联系。本研究结果有望为雨水清洁生产过程中储罐的功能提供新的启示，并为后续处理单元的设计和优化提供参考。

在这项研究中，反应器R1和R2分别用于模拟新旧雨水储罐。R1是一个生物膜稳定的老反应器，在与本实验相同的水质条件下连续预运行半年。R2是一种新的反应器，它使用进水中的微生物作为来源，随着时间的推移自然形成生物膜。

首先，进行三次静态实验，验证储罐生物膜的净水效果。具体而言，将进水倒入两个反应器中，并以预设的时间间隔（2、4、6、8、12、24和48小时）收集出水样品以确定污染物浓度。此外，还进行了100天的动态实验，比较了新旧雨水储罐的生物净水性能差异。根据静态实验结果，选择12 h作为初始HRT进行动态运行，直至污染物去除达到稳定水平。然后，进一步缩短HRT，考察储水池是否能达到同样好的生物净水效果。因此，动态实验由不同HRT的三个阶段组成：阶段Ⅰ（HRT = 12 h，0-40 d），阶段Ⅱ（HRT = 4 h，41-70 d）和阶段Ⅲ（HRT = 1 h，71-100 d）。通过蠕动泵控制进水流量来调节储罐的水力停留时间。

定期采集水样并通过 0.45μm 膜过滤进行分析。COD、NH 4 + -N、亚硝酸盐氮（NO 2 - -N）、硝酸盐氮（NO 3 - -N）、TN和TP的浓度按照标准方法进行测定。通过总有机碳分析仪测定 DOC 含量，并使用紫外分光光度计根据254 nm 波长的紫外吸光度测量。异养细菌使用标准扩散板技术在R2A琼脂上计数。通过扫描电子显微镜分析生物膜的微观形态。

在40、70和100天从R1和R2收集了6个生物膜样品，用于提取DNA，每个样品都是一式3份样品的混合物。样品的DNA储存在-80ºC以供后续分析。利用天昊Accu16S^®细菌绝对定量测序（V3-V4 区）进行微生物多样性检测。

本研究采用全尺度分类方法对雨水蓄水池中生物膜细菌群落组成进行综合分析。在属水平上，通过将每个属的拷贝数除以每个样本的总拷贝数将样本的绝对丰度转化为相对丰度，将所有属分为5个细菌类群，包括丰富类群（AT），有条件地丰富类群（CAT）、条件稀有或丰富类群（CRAT）、条件稀有类群（CRT）和稀有类群（RT）。通过主成分分析（PCA）分析不同细菌类群之间群落结构的相似性。

不同HRT下雨水储罐的自净性能

静态实验结果显示，与有机物、氮、磷有关的各种污染物在R1中均有一定程度的去除，远高于R2中的去除效率，体现了雨水储存罐生物膜在自净功能中的重要作用。长期动态实验显示了长期运行过程中的污染物去除性能。出水COD和DOC浓度在Ⅰ期持续下降，在Ⅱ期和Ⅲ期趋于稳定。在HRT变化初期观察到出水水质的波动，反映了微生物对环境变化的适应过程。在长期运行过程中，R1对有机物、氮、磷的去除性能始终高于R2。另外，随着HRT的缩短，出水异养菌的数量减少，说明储存时间短有利于控制悬浮菌的滋生，保证雨水水质的生物安全。值得注意的是，R2中的异养菌数量高于R1，尤其是在Ⅰ期。这些结果表明，雨水储罐壁上的生物膜具有净水功能。适当缩短HRT有利于提高污染物去除效率，减少雨水中的细菌数量。

生物膜细菌群落的全面分类

细菌群落多样性和结构分析发现，旧生物膜的Shannon、inverse Simpson、Chao 1和ACE指数先略有上升，然后随着时间的推移而下降。然而，在新的生物膜生成过程中，所有这些指标都逐渐下降。细菌多样性的丧失可能是由于优势菌的富集造成的。相比之下，R1中的多样性和丰富度估计量略高于R2，表明老生物膜的群落多样性较高，因此旧水箱可能具有更好的生物稳定性。此外，PCA揭示生物膜群落结构。如图1a所示，前两个主成分分别解释了总群落方差的41.04%和34.50%。值得注意的是，R1样本的分布比R2更分散，表明旧生物膜的群落结构随时间变化大于新生成的生物膜。这些结果表明，生物膜生成的时间在塑造细菌群落结构方面发挥了关键作用。

对细菌群落组成分析发现，AT和CRAT在生物膜细菌群落中占优势。AT的绝对丰度随着时间的推移逐渐增加，即优势细菌的富集可能是群落多样性下降的原因。CAT、CRT和RT的绝对丰度较低且略有波动（图1b）。Acidovorax和Azohydromonas是仅有的两个被识别为AT的属（图1c）。有3个属被确定为CAT（图1d）。共有19个属被归类为CRAT（图1e）。

图2a显示了分类为CRT的55个属中的前20个。R1_40 d和R1_70 d的群落组成相似，而 R2_40 d中的优势细菌和R2_70 d是不同的。如图2b所示，R1_40 d中的属显示出较低的绝对丰度。Prosthecobacter、Ralstonia和Defluviimonas随着培养时间的延长不断富集。至于R2 中新形成的生物膜，40日生物膜的主要属为Caulobacter和Aridibacter，Ralstonia是70天生物膜中的主要属，而Sediminibacterium在100天生物膜中的丰度相对较高。

与AT和CAT相比，R1和R2的CRT和RT的组成和丰度差异更大。与稀有属相比，丰富属的生长速度更快，对生存环境的适应性更好，而稀有属的种间竞争能力较差，导致它们在生物膜形成过程中发生更替。

在充分了解了五种细菌类群的组成后，通过网络分析进一步研究了它们之间的相互作用。在62个节点之间共识别出241条边（图4c），206条边显示相同和不同分类群之间的显着正相关。这些结果表明，属之间的相互作用以共现模式为主，一些低丰度的属由于它们在微生物群落网络中的重要关联作用，在未来应该得到更多的关注。

图2、属水平生物膜细菌群落的稀有分类群组成（前20名）（（a）CRT和（b）RT）以及R1和R2中五个细菌分类群（c）之间的相互作用。（原文图4）

功能性细菌和基因分析

功能性细菌的高水平多样性和活性有助于污染物的去除。为了分析雨水箱生物膜中的功能属，构建了一个热图，如图3a所示。Nitrosomonas、Nitrospira和Mesorhizobium是重要的氨氧化菌（AOB）、NOB和固氮菌（NFB），但它们都表现出低丰度。在25个DNB中，AT的嗜酸菌属是优势属，并且随着时间的推移在生物膜中富集。一般来说，大多数功能性细菌都富含生物膜的生成，这在一定程度上支持了污染物去除效率的提高。

通过网络分析研究了功能属之间的相互作用。如图3b和3c所示，R1网络中的28个节点被分为四组，而R2网络中的30个节点被分为六组。同时，R1（167）网络的边数比R2（91）网络的多，且两个网络均以正相关为主。这些结果表明，功能属之间的共现模式占主导地位，老生物膜中功能属的相互作用更为复杂。随着生物膜的发展，稀有属逐渐在细菌群落中发挥着不可忽视的作用。功能属之间的共生关联有利于它们的生存，可以促进生物水净化的功能。

基于KEEG数据库分析功能基因和氮代谢途径，揭示氮转化机制。如图3d所示，雨水蓄水池包含一个复杂的氮代谢网络，包括硝化作用、氨同化作用、反硝化作用、异化/同化硝酸盐还原和固氮作用。实验发现，氨同化、完全反硝化和异化/同化硝酸盐还原可能是雨水蓄水池中主要的氮代谢途径。

图3、生物膜细菌群落的功能细菌分析：（a）热图；(b)-(c)分别对R1和R2进行网络分析；(d)氮代谢途径。（原文图5）

细菌群落与环境因素的相关性

通过RDA评估细菌群落与环境因素之间以及功能属与环境因素之间的相关性。如图4a表明，群落的代谢活动可能对水的化学质量产生有益的影响。然而，大多数属与HRT和温度呈负相关。许多功能性细菌，与NH4⁺-N、COD和TP的去除效率呈正相关（图4b）。HRT仅与Nitrosomonas和Candidatus呈正相关，而与其他功能菌属呈负相关，说明雨水长期储存在水箱中不利于功能菌的富集。

进一步应用VPA定量评估运行参数（A：HRT）、温度（B：T）和水质（C：COD、DOC、NH4⁺-N、TN和TP）对生物膜群落和功能细菌的动态。如图4所示，60.02%的变化可以用这三个成分来解释。重要的是，运行参数、温度和水质共同对群落变化贡献了17.94%，表明三个主要成分之间相互作用的显着影响。总体而言，HRT与大多数优势菌和功能菌呈负相关，运行参数、温度和水质的组合对生物膜细菌群落的变化表现出最大的解释。

图4、RDA分析显示前20个属与环境因素(a)以及功能属与环境因素(b)之间的相关性；VPA 评估了环境因素对细菌群落(c)和功能细菌 (d) 变化的贡献。A、B、C 分别代表运行参数、温度和水质。（原文图6）

生物膜的存在增强了雨水蓄水池的自净功能。适当缩短HRT有利于提高污染物去除性能和水质生物安全。AT和CRAT在五个细菌类群中占主导地位。功能性细菌随着时间的推移而富集并形成复杂的相互作用。氨同化、完全反硝化和异化/同化硝酸盐还原可能是主要的氮代谢途径。HRT对群落变异有很好的解释，而长时间的HRT不利于功能性细菌的生长。以蓄水池为预处理单元，充分利用其生物净水功能，可以减轻后续处理单元的负荷，有利于雨水清洁生产的可持续性。

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