天昊生物专利技术--Accu16S®细菌绝对定量测序在农业种植领域再有新突破！近日，来自海南省农业科学院果树所的科研人员在《Frontiers in Microbiology》（IF=6.064）上发表论文。该研究利用天昊Accu16S®细菌绝对定量测序专利技术，深入探讨了荔枝园间作平托花生对土壤性质、酶活性以及土壤细菌群落结构和多样性的影响。
英文题目：Intercropping Pinto Peanut in Litchi Orchard Effectively Improved Soil Available Potassium Content, Optimized Soil Bacterial Community Structure, and Advanced Bacterial Community Diversity
中文题目：荔枝园间作平托花生有效提高了土壤速效钾含量，优化了土壤细菌群落结构，提高了细菌群落多样性
期刊名：Frontiers in Microbiology
发表时间：2022年5月
影响因子：6.064
荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是一种原产于中国的南亚热带水果。“妃子笑”是一种早熟荔枝品种，在海南省广泛种植。该品种开花期花量大，消耗土壤养分过多，果实不易保存，土壤缺钙、缺水严重影响花叶正常生长。花生又名平托花生，是热带和亚热带豆科多年生匍匐草本植物。一些研究表明，它是生态果园中优良的共生植物，不仅可以改善小气候和控制杂草生长，还可以改善果实品质。间作是一种在同一块田地附近同时种植两种或多种作物的农业生态实践，广泛用于作物生产。最近，间作因其在提高产量稳定性和单位面积产量、减少害虫问题和对农用化学品的需求以及刺激生物多样性方面的潜在优势而受到越来越多的关注。研究表明，与单一栽培相比，玉米与短粒谷物或豆类的混合物的绝对产量增益最大。此外，间作系统显著改善了土壤性质、养分利用效率和土壤微生物多样性。土壤养分和土壤酶活性是生态系统生产力的关键因素。土壤酶作为土壤质量的指标，对土壤中有机质的合成和降解至关重要，并在微生物和植物分解过程中催化生化反应中发挥关键作用，尽管已经进行了许多间作研究，强调作物产量及其对土壤性质的影响，但很少有研究清楚地证明微生物群落结构与土壤环境之间的相互作用。尤其是荔枝园间作花生对土壤养分、酶活性、土壤细菌群落结构和多样性的影响尚不清楚。本文采集了荔枝与平托花生间作和荔枝单作的土壤样品，以阐明间作对土壤性质、酶活性以及土壤细菌群落结构和多样性的影响。
荔枝栽植株距4×5m。在距荔枝茎基部1.5m处种植了平托花生，每平方米土地密植了36株花生苗。该实验针对两种处理设计，即荔枝与平托花生间作（LP）和荔枝单作（CK）。在平托花生生长期采集土壤样本。在荔枝根系与花生交界处用五点抽样法取样。每个处理重复3次，收集的样品分为三部分：一部分-80ºC保存，用于Accu16S®细菌绝对定量测序分析（V3-V4区），一份风干用于测定土壤化学性质和土壤酶活性。土壤性质分析包括：土壤总有机碳（SOC），总氮（TN）、总磷（TP）、总钾（TK）和有效氮（AN）、有效磷（AP）、有效钾（AK）、硝态氮（NO3--N）、铵态氮（NH4+-N)、水分含量、pH。土壤酶活性的测定包括：土壤蔗糖酶（s-SC）活性、土壤脲酶（s-UE）、土壤过氧化氢酶（s-CAT）、土壤多酚氧化酶（s-PPO）和土壤蛋白酶（s-PT)。其余土样4ºC保存。
间作对土壤细菌群落的影响间作对土壤细菌丰度的影响PCoA的结果显示，其中单作土壤CK的细菌群落与间作处理LP中的细菌群落明显分离，表明两组微生物群落组成明显不同，微生物结构在间作处理和单作处理之间存在显著差异。此外，系统发育树显示，3个间作土壤LP样品的细菌群落绝对丰度均显著高于CK的所有分类水平，表明LP土壤中总物种绝对丰度显著增加。两种种植模式土壤细菌群落的α多样性分析表明，荔枝园间作花生可显著提高土壤细菌丰富度和多样性。与CK相比，LP代表样本群落丰富度的Chao1和ACE指数在间作组中显著升高。此外，与群落结构多样性呈负相关的Simpson指数降低了6.6%。这些结果表明，间作可以促进土壤微生物群落结构的丰富性和多样性。之后进行LEfSe分析，以确定样本组间丰度变化的特定分类群（图1）。所有分类水平丰度的分支图显示，其中LP组中丰度显著较高的物种（差异显著的特有物种）在所有分类水平上均高于CK组。LP组土壤中具有显著差异的特有物种比CK组高60余倍。前10个分类单元显示在图1B。这些物种组成的多样性可能是导致群体间群落结构差异的关键因素。上述结果表明，荔枝与花生间作可以大大提高土壤中细菌群落结构的多样性。
图1、根据线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析在LP组和CK组中具有不同丰度的分类群。（A）LEfSe生成的分支图。（B）直方图为前10个分类群。（原文图3）
间作处理土壤细菌群落结构门水平细菌群落的组成分析如图2所示。两组之间有6个门的绝对丰度存在显著差异（图2C)。与CK组相比，LP组的Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Chloroflex、Bacteroidetes和Planctomycetes显著增加（图2B）。属水平细菌群落组成分析平均绝对丰度>1%的菌群有16个属，其中CK组12个，间作LP组14个。间作组共有98个细菌属的绝对丰度较高。
图2、门水平细菌群落的组成分析。(A)间作LP组土壤细菌组成变化的条形图。(B) LP和CK组土壤细菌绝对丰度(>1%)变化的气泡图。(C)门水平土壤不同细菌组成的热图。（原文图4）
土壤性质与土壤细菌群落和酶活性的相关性
研究使用冗余分析（RDA）来探讨土壤性质对微生物群落的影响（图3）。在属水平上，第一轴（RDA1）解释了74.61%的变异，第二轴（RDA2）解释了15.87%的变异，总共解释了高达90.48%的细菌群落变异。综上所述，AK是最主要的环境因子，其次是pH、AP和TK，这四个指标占微生物群落总变化的96.80%，影响了土壤微生物结构。在属水平上，占主导地位的属，即Flavobac、Nitrosos、Rhodopln、Gaiella、Gp6、Pseudolb、Gp5和Gp4，与AK呈正相关，但与pH呈负相关。此外，Bacillus、Gp1、Gp2、Gp3和Gp7与pH呈正相关，但与AK呈负相关（图3B）。在门水平，RDA分析结果与属水平一致（图3A）。此外，还分析了土壤性质与土壤酶活性之间的Pearson相关系数，其中AK与PPO显著正相关，UE和碱性PT分别与SOC和TN显著正相关。此外，AN与 SC、UE和CAT呈显著负相关。此外，土壤 pH 值的升高显著降低了UE和碱性PT的活性。综上所述，间作可以影响土壤微生物环境，增加土壤酶活性，并可能提高土壤AK含量。
图3、在门水平(A)和属水平(B)的所有与环境变量相关的样品中与主要土壤细菌群落的冗余分析(RDA) 。CK，荔枝单一栽培；LP，荔枝与花生间作；TP，总磷；TK，总钾；AK，有效钾。（原文图6）
土壤微生物群的功能预测
为了确定两组之间功能预测的差异，基于Accu16S®细菌绝对定量测序数据，使用PICRUSt2分析工具比较了两组中功能基因的绝对丰度（图4）。KEGG数据库注释了68个KEGG直系同源物（KO），显示两组之间存在显著差异。受影响的三个水平（L1、L2和L3）有58个功能基因，在间作土壤样品中绝对丰度较高，尤其是那些负责代谢、转运蛋白、ABC转运蛋白，以及DNA修复和重组蛋白。同时，实验还观察到在L3水平代谢类别中占高比例的功能基因增加的差异，即氨基酸代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、能量代谢以及辅因子和维生素代谢。结果表明，间作提高了土壤细菌的功能，尤其是细菌的代谢活性。II型聚酮骨架的生物合成和黑色素生成途径在间作组中显著升高（图4D）。聚酮化合物是一大类化学结构多样、生物活性丰富的次级代谢产物，包括多种抗生素、抗真菌剂、细胞抑制剂、抗胆碱能结合剂、抗寄生虫剂、动物生长促进剂、天然农药等，广泛应用于临床或其他领域。LP和CK在II型聚酮骨架生物合成上的显著差异可能与间作对土传病害的抗性密切相关。
图4、土壤微生物群的功能预测。（A-C）分别代表KEGG数据库中注释的1-3级功能基因；(D)组间通路基因显著不同，CK，荔枝单一栽培；LP，荔枝与花生的间作。（原文图7）
本研究证明了荔枝单作模式和荔枝园间作4年以上的平托花生在土壤性质、土壤酶和土壤细菌群落方面的差异。综上所述，间作土壤的土壤AK含量显著高于荔枝单作，土壤微生物结构显著优化，因为AK是影响细菌群落多样性的主要环境因素。LP中SC、酸性PT和UE的活性高于CK。间作土壤细菌的丰富度和多样性高于CK，土壤细菌群落结构明显优化为间作模式，有利于荔枝栽培的优越土壤环境条件。通过对土壤微生物群的功能预测分析，推测对土传病害的抗性与间作模式下的土壤细菌群落结构高度相关。基于LP和CK之间AK和AN含量的差异，需要进一步研究土壤性质和微生物群落的长期动态变化。
海南省农业科学院果树所赵亚助理研究员为该论文的第一作者，范鸿雁研究员为该论文的通讯作者。该研究得到海南省重大科技计划项目（ZDKJ2021006）、国家重点研发项目（2017YFD0202106）和海南省重点研发项目（ZDYF2018236）的支持资助。
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