在细胞生物学中，基因过表达和敲除/敲降技术通常成对用于研究选定的基因。在肠道菌群研究中，细菌植入和悉生动物模型常用于对感兴趣细菌的研究。然而，在肠道菌群研究中，仍然没有敲除/敲降细菌的标准方案。
英文题目：Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model
中文题目：噬菌体可以通过对肠道细菌的选择性敲除产生靶向敲除细菌小鼠模型
期刊名称：Cell Reports Methods
肠道微生物组对人类健康至关重要。小鼠微生物群模型，包括悉生小鼠，是阐明肠道细菌功能的最有用工具。在这里，文章提出了一种靶向细菌敲除（TBD）模型，使用裂解噬菌体选择性地敲除健康或其他模型小鼠的肠道细菌。这些噬菌体处理的动物除了敲除的细菌，应该具有几乎完整的肠道细菌谱。为了证明这一概念，研究者采用大肠杆菌特异性噬菌体T7来抑制健康小鼠中的大肠杆菌。实验结果表明，敲除大肠杆菌的小鼠表现出类似勇敢的行为，并且与大肠杆菌的存在相关，而不是肠道细菌之间的平衡。因此，研究者证明TBD模型是一种阐明近乎完整肠道菌群环境中特定细菌物种功能的有力工具。
肠道是人体中最大的微生物群库，存在着一系列细菌、真核生物和病毒。肠道细菌的多样性和相互作用极大地影响宿主的新陈代谢，与人类健康的诸多方面息息相关。例如，肠道菌群可以调控宿主免疫反应，微生物群组成的改变能够影响一系列疾病的发生发展此外。药物作用通常会对肠道菌群产生影响，会对如用于治疗精神分裂症等心理健康状况的疗法产生了深远影响。
微生物群-肠-脑轴（MGB）是微生物群-宿主相互作用的典型例子。MGB从肠脑轴（GBA）扩展而来，它描述了大脑和肠道神经系统之间的双向通信，描述了肠道菌群与中枢神经系统之间的关系。例如，肠道微生物可以产生神经活性分子，通过迷走神经在肠道神经系统和大脑之间发出信号。在胁迫条件下，微生物群的组成也可以通过下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）通过肠上皮细胞进行调节。一些肠道细菌的丰度与心理健康状况相关，称为心理生物组（psychobiome）。例如，肠道中的Streptococcus vestibularis可以诱导精神分裂症样行为，抑郁症患者的Coprococcus和Dialister水平通常降低。
大肠杆菌占肠道菌群的0.1%-5%，是一种特征明确的模式生物，可用于研究MGB。虽然它产生对哺乳动物宿主功能至关重要的维生素K和B12，但它也可能诱发患者的精神症状。此外，具有诱导焦虑样行为的小鼠肠道大肠杆菌水平升高。研究者目前对MGB的大部分理解都是使用具有抗菌处理的人造动物模型确定的，包括无菌小鼠和无特异性病原体（SPF）小鼠。这些动物模型有其自身的优势：抗生素处理的小鼠模型易于研究，但无法评估单个细菌菌株的影响。虽然使用接种了选定微生物无菌小鼠的悉生小鼠模型是研究特定菌株的金标准，但其生理影响在自然环境中可能不具有代表性。此外，使用悉生生物模型的研究既耗时又昂贵。
在这里，研究者提出了一种新的动物模型，该模型结合了悉生小鼠模型在细菌菌株精度方面的优点，以及仅使用普通小鼠即可建立的便利性。通过使用裂解噬菌体，可以在动物模型中靶向敲除特定的肠道细菌。为了证明这一假设的可行性，研究者选择使用大肠杆菌特异性噬菌体T7从健康小鼠的肠道中去除大肠杆菌，并通过分子和表型分析来检测其影响(图1)。令人惊讶的是，这些靶向敲除大肠杆菌（TBD）小鼠表现出类似于先前发表的抗焦虑和抗抑郁治疗效果的行为变化。与对照组相比，这些原本健康的动物获得了“勇敢”的个性，没有过度活跃。因此，本研究表明TBD小鼠模型提供了一种与传统悉生模型互补的方法来验证实验数据，并且可以通过选择不同噬菌体来研究各种肠道细菌。
本研究使用健康的6周龄雌性C57BL/6J小鼠，用大肠杆菌噬菌体T7与大肠杆菌（菌株K12）进行处理。在噬菌体处理后第0、1、2、4、6、8、10、12和14天收集粪便样品。本研究行为测试包括：旷场实验、互惠社交互动测试、三箱社交测试、高架十字迷宫试验、新物体识别测试、新颖性抑制饲养试验和悬尾实验。行为实验后，每组随机3只小鼠，对肠道等器官进行组织学分析。
本研究使用天昊生物Accu16S®绝对定量测序技术，对小鼠肠道细菌的绝对丰度和多样性进行分析。此外也使用了qPCR实验对小鼠粪便中的细菌和大肠杆菌，以及T7噬菌体总量进行检测。
T7噬菌体给药对小鼠身体状况无明显影响为了验证研究者的模型，使用靶向大多数大肠杆菌菌株的T7噬菌体。本实验通过小鼠胃内给药处理方式，分别设置了106 PFU/mL T7（T7L）、1011 PFU/mL T7（T7H）、1011 PFU/mL 失活T7（高压灭菌处理）（dT7H）和水处理共4个平行组，并测量各种生命体征，收集粪便样本，并定期进行一系列行为测试（图2A）。正如预期的那样，T7噬菌体处理后对小鼠的身体状况没有明显影响（图2B）。T7噬菌体选择性敲除大肠杆菌但不影响整体肠道细菌群研究者使用qPCR来量化大肠杆菌和总肠道细菌的数量，以跟踪噬菌体给药后的动态变化。在14天的过程中，所有组中的肠道细菌总体种群没有显示出明显的扰动。相比之下，T7H组与对照组相比，大肠杆菌迅速降低至∼10%，并在第14天逐渐恢复至∼25%，可能是由于其对噬菌体的获得性抗性。此外，T7L组大肠杆菌的下降在第6天后开始，并在第8天时达到与T7H相同比例（图2C）。
图2、T7噬菌体抑制大肠杆菌水平但不影响身体状况和肠道细菌的整体种群。（A）本研究中使用的时间框架和行为测试的示意图（每组n = 12）。OFT，旷场实验；RSIT，互惠社交互动测试；TCST，三箱社交测试；EPM，高架十字迷宫试验；NOR，新物体识别测试；NSF，新颖性抑制饲养试验；TST，悬尾实验。（B）身体状况：在不同时间测量的体重（左），每日饮水量（中）和每日食物摄入量（右）（每组n = 12）。（C）通过qPCR随时间定量的大肠杆菌水平（左）和总细菌水平（右）随时间变化（每组n = 12）。
大肠杆菌敲除导致肠道菌群中物种代表性的减少为了研究大肠杆菌减少的级联效应，研究者使用天昊生物Accu16S®绝对定量测序技术，通过对16S rRNA基因扩增子（V3-V4区）进行测序来获得微生物分类单元的绝对丰度，以评估肠道菌群的动态变化。实验在4个时间点（即0天和T7噬菌体处理后4、8和14天）研究了粪便微生物群组成。结果发现Chao1指数存在显著性差异，但香农和辛普森多样性指数没有显著影响。相对于对照小鼠，大肠杆菌敲除小鼠的肠道中细菌丰富度降低（图3）。时间和T7噬菌体对微生物组成的β多样性均有显著影响（图3D）。随着T7噬菌体处理，敲除大肠杆菌小鼠肠道菌群β多样性逐渐降低，其β多样性在第8天升高，但在第14天下降。在噬菌体灌胃后第4天和第14天，大肠杆菌敲除小鼠中25和31个肠道细菌属的绝对丰度与对照小鼠存在差异。此外，24个肠道细菌属的丰度表现出明显的纵向变化，而两组之间微生物群的纵向改变模式不同（图3E）。
大肠杆菌敲除的小鼠表现出行为异常为了探讨肠道大肠杆菌对宿主的影响，研究者进行了7项行为测试，涵盖精神状态和社交能力，其中五项测试显示T7H组与对照组比较。在旷场实验（OFT）中，虽然每组的总距离没有差异，这表明各组之间的基础运动活动相似，但T7H小组在明亮的开放区域花费了更多时间，并表现出类似于抗焦虑药给药的行为模式（图4A）。在高架十字迷宫（EPM）实验中，小鼠在T7H组更频繁地进入高悬敞开臂，并持续更长时间，这显示出与先前报道的抗焦虑小鼠相似的模式（图4B）。在新颖性抑制饲养（NSF）实验中，由于NSF对急性抗焦虑药和慢性抗抑郁药治疗敏感，但对急性抗抑郁药不敏感，因此两个T7处理的动物组都表现出类似于先前描述的抗焦虑药给药的行为（图4C）。在悬尾实验（TST）中，来自两个T7处理小鼠的不动时间T7H和T7L明显短于对照组（图4D）。由于TST通常用于评估抗抑郁活性，噬菌体T7作为一种有效的抗抑郁药，但不是抗焦虑药。相比之下，这些群体的一般社交能力和对社会新奇的兴趣之间没有差异。这些指标通过三箱社交测试（TCST）进行评估，自闭症相关的行为缺陷通过互惠社交互动测试（RSIT）评估，小鼠的学习和记忆通过新物体识别（NOR）测试进行评估，这表明小鼠的一般社交能力和记忆不受噬菌体的影响（图4E）。值得注意的是，大肠杆菌种群T7L组下降到T7H组在第8天的水平，正是在这个时间点，T7L组开始表现出与T7H相似的行为异常。因此，两个实验组的结果表明，小鼠的行为障碍与大肠杆菌种群直接相关，而不是对整个肠道菌群的级联效应。
噬菌体处理小鼠的主要器官未发现病理异常在解剖学上，各组小鼠小肠和大肠上皮表现出反应性增生，保留了正常的腺体结构和核极性（图4F），细胞显示出核质比轻度增加，细胞核略微增大，核深染和有丝分裂率增加，而不存在明显的多形性和非典型有丝分裂。此外，其他主要器官没有观察到异常，即脑、心、肺、肝、脾和肾的病理形态在所有组间没有差异，这表明宿主的生理健康不太可能与行为改变有关。
该研究获得国家科技部重点专项、国家自然科学基金、陕西省重点研发计划的资助，并获得了西安交通大学第一附属医院生物样本信息资源中心和脑科学研究中心的大力支持。西安交通大学博士生李琰清，西安交通大学第一附属医院朱峰教授、李燕教授文章共同第一作者，刘冰教授、马现仓教授、王亚文教授为文章共同通讯作者。
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