恭喜！天昊扩增子绝对定量测序助力客户林业科学研究喜登《Microbiology Spectrum》

发稿时间：2023-02-06来源：天昊生物

近期，来自中国林业科学研究院林业研究所段爱国研究员和张建国研究员团队的科研人员，联合中国林科院热带林业实验中心，在国际知名学术期刊《Microbiology Spectrum》上发表研究论文。该研究利用天昊微生物创新型Accu16S^®绝对定量测序等检测方法，比较了纯杉（Cunninghamia lanceolata）人工林（S）、杉木-红锥-香籽含笑（Cunninghamia lanceolata-Castanopsis hystrix-Michelia hedyosperma）混交人工林（SHX）和杉木-黧蒴栲（Cunninghamia lanceolata-Castanopsis fissa）混交林（SD）中根际土壤细菌群落的结构和多样性，以及与土壤的理化性质的关系，进而发现了不同混交模式下杉木根际细菌群落的绝对数量差异，强调了近自然森林经营对杉木人工林根际细菌群落的重要性，为影响华南地区林地根际土壤的细菌群落因子提供了新的重要信息。

根际区作为植物吸收水分和养分并与土壤基质相互作用的门户，在植物生命和土壤生态系统中起着举足轻重的作用。在自然界中，根与土壤之间的相互作用非常复杂，根际微生物积极参与其中。根际土壤的性质在很大程度上取决于土壤、植物和根际微生物的相互作用。一些根际微生物可以固定氮，溶解磷、钾以及其他微量营养素，并帮助根系有效吸收这些营养。相反，关键根际土壤养分如碳、氮和钾的变化可以显著影响土壤微生物群落和植被的恢复。它们之间的无数相互作用使得根际土壤的性质、土壤酶活性和微生物与非根际土壤显著不同。此外，土壤类型、植物生长阶段、耕作方式和其他环境因素都可能影响根际微生物群落的组成。除了根际养分与根际微生物的相互作用外，根际微生物的结构和功能多样性往往受到植物物种的影响，这主要是由于根系分泌物和根际沉积在不同根区的差异。根际沉积，包括根细胞的脱落和物质如糖、有机酸和氨基酸的渗出和泄漏，可以被微生物用作底物来增加其生物量和活性。

“近自然”的概念是在1990年代后期引入中国。在近天然森林经营中，实施了择伐和树木自然更新等过程，以创建以多树种和多层为特征的异龄复层林分。为此，首先在纯人工林中通过高强度间伐创建林窗，然后将其他树种在森林冠层下间植，形成近自然混交林。纯林向混交林的转变通常会改变其林分的灌木丛植被和空间结构。与纯林相比，通过近自然森林经营形成的混交人工林增加了乔木层、灌木层和草本层的生物量，并提高了生态系统的碳固定能力。马尾松林下套种不同阔叶树种提高了土壤全氮、有机质、碱解氮、速效磷和速效钾的含量。同样，将纯杉木林转变为混交林提高了其养分含量并改善了土壤性质。在近自然森林经营下，土壤微生物的活性不可避免地会受到地上植物部位相应的影响。

杉木是中国南方重要的速生丰产树种。然而，由于杉木人工林多以纯林培育，轮伐期较短，导致出现人工林地力衰退和生产力下降，不利于杉木人工林的可持续管理。但是，通过林分间伐和套种，将纯针叶林转变为由不同大小和年龄的针阔叶混交树组成的近天然林，正逐渐成为中国替代大面积针叶纯林的最有希望的方法之一。然而，目前对杉木人工林近天然林管理的研究主要局限于其对林下植被多样性、林分空间结构和林分生长的影响。因此，本研究利用微生物16S rRNA基因绝对定量技术，分析了不同树种根际土壤细菌群落的多样性和结构。研究结果揭示了经近自然森林经营形成的异龄复层林分和树种类型对不同混交林下根际土壤细菌群落的影响及其与土壤养分的关系，为维持杉木人工林土壤肥力和确保其长期生产力提供了实践依据。

本研究试验地点位于广西省凭祥市大青山伏波林场，地处低纬度地区（南亚热带）（图9a）。该地区主要地貌类型为低山和丘陵，以砖红壤和红壤类型为主。自1993年起，近天然试验林开始造林，初始密度为3,000株/公顷，之后通过森林管理，包括两轮林分疏伐，最终保留密度为375至585株/公顷。2008年，在杉木树冠下种植了阔叶树苗。最后形成了两个混合人工林SHX和SD。不同的混合林分及其缩写如图9b和c所示。2019年对两个混合人工林（SHX和SD）以及纯中国杉木林（S）进行实验检测。

土壤取样方面，清除树干基部的地表杂草和松散土壤后，使用抖除法在距树干基部50cm的土壤层（0-20cm）中收集根际土壤。按照标准方法取样后，每个样品分成两部分：一部分储存在-80ºC用于微生物16S rRNA基因绝对定量测序，另一部分储存在4ºC用于土壤理化性质测定。土壤理化性质测定包括土壤有机质（SOM）、总氮（TN）和水解氮（AN）、总P（TP）、有效P（AP）的浓度，以及土壤pH值。土壤细菌群落分析是将土壤样本送到上海天昊生物有限公司，进行DNA抽提、16S绝对定量测序及生信分析。统计分析方面，采用单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验，分析3种人工林和不同树种根际土壤理化性质的差异。使用Mothur（v39.3.22）计算细菌α多样性，包括Chao1指数，ACE指数，香农指数和辛普森指数。检验了根际土壤理化性质与细菌群落绝对丰度之间的Pearson相关性，并采用冗余分析（RDA）分析了根际土壤理化性质对细菌群落物种组成的影响。采用主成分分析（PCA）来比较不同树种和不同混交林之间微生物群落组成的异同。之后使用网络工具对细菌相互作用网络和LDA效应大小（LEFSE）进行计算和绘制。

（i）根际土壤的理化性质。在近天然林管理下，杉木根际土壤理化性质变化显著（表1）。在SHX_S中的根际土壤，比在S_S中或SD_S中的TP含量明显升高，但AP含量正好相反。其他5项指标在3种林分类型间无显著性差异。

（ii）细菌群落组成和多样性。为研究不同混合模式中杉木根际细菌群落的多样性和结构，本研究对16S rRNA基因进行了高通量绝对定量测序。结果表明，混交处理下杉木根际细菌OTU量比纯林高，其中SHX_S的值最高（图1c）。更多独特的OTU出现在SHX_S和SD_S的根际土壤中。接下来，研究评估了这些细菌OTU的分类分布（图1a和b）。无论是门还是属水平，不同混交林中杉木根际土壤的细菌群落组成均无显著差异。然而，SHX和SD中杉木根际土壤细菌群落的总绝对丰度高于S。鉴定出7个绝对丰度>1%的门（图1a）。Acidobacteria和Proteobacteria在杉木根际细菌群落中占主导地位。在属水平，14个属的比例>1%。为了确定不同混合模式的杉木根际土壤细菌群落中物种之间的差异，研究者同时使用了ANOVA和LEFSE算法分析了在绝对丰度上有显著差异的菌种（图1d）。

本研究分析了所有样品中的α多样性指数，以评估根际土壤细菌群落的丰富度（图2a）。除辛普森指数外，根际细菌群落的其他3个多样性指数在SHX_S中最高。纯林到混交林多样性指数的变化表明，近自然森林管理提高了杉木根际细菌群落的物种多样性和均匀性。PCA分析显示，前两个轴解释了60.78%的差异（图2b）。SD_S样品与S_S、SHX_S根际土壤样品的分离表明，SD_S与其他两种林分类型之间存在很大差异。

对属水平前40种细菌的网络分析表明，混交林杉木的节点数比纯林多，边更少（图2c）。这些结果表明，与S_S相比，SD_S和SHX_S的相互作用网络相对简单，但细菌之间的复杂性更高。

（iii）土壤理化性质与细菌群落结构的关系。根据根际土壤细菌群落绝对丰度与土壤理化参数之间相关性热图分析发现，在门水平，SOM、TN和SOC与Bacteroidetes呈显著正相关。AN与Gemmatimonadetes呈显著正相关，与Chloroflexi呈显著负相关。虽然TP与Verrucomicrobia呈显著正相关，但AP与其呈显著负相关（图3a）。冗余分析（RDA）表明，SOM、TN、AN、TP和pH值是显著影响土壤根际微生物的环境因子。RDA轴1和轴2分别获得了29.97%和20.33%的细菌变异。在门水平上，SOM对杉木根际土壤细菌群落的影响最大（图3b）。

同一混交林不同树种间的根际土壤分析

（i）根际土壤的理化性质。如表2所示，SHX_S根际土壤AP含量显著高于SHX_H和SHX_X。SHX_X根际土壤pH值最高，SHX_S的pH值最低。对于SOM、SOC、TN、TP和AN含量均呈SHX_S > SHX_H > SHX_X趋势，而pH值呈SHX_S < SHX_H < SHX_X趋势。除pH和TP外，根际土壤中SOM、SOC、TN、AN和AP含量SD_S均低于SD_D。SD_D的pH值低于SD_S。

（ii） 细菌群落的组成和多样性。SHX_S、SHX_H和SHX_X的细菌群落分别包含5,322、5,619和5,263个OTU（图4c）。SHX_S细菌群落的总绝对丰度分别比SHX_X和SHX_H高181.74%和148.31%（图4a）。在门水平上，检测到比例>1%的13个门。在属水平上，共检测到比例>4%的2个属（图4b）。

SD_D和SD_S根际土壤样品中分别有5,163个和5,308个细菌OTU（图5c）。SD_S和SD_D的细菌群落分别有1,315个和1,170个独特的OTU。如图5a和b中的数据所示，SD_S和SD_D根际细菌群落的组成相似。Acidobacteria和Proteobacteria是SD_D和SD_S的主要菌门，前者的绝对丰度最高。SD_D的绝对丰度显著高于SD_S（图5a）。在属水平，有10个属的比例>1%（图5b）。本研究分析了SHX和SD中不同树种的LDA值。结果表明：在SHX中，Anaerolineaceae（Chloroflexi）在SHX_X中富集，LDA得分最高（3.571）；Actinobacteria在SHX_S富集，LDA值为4.124。Salmonella在SHX_H中富集，LDA评分高达3.202（图4d）。在SD中，Proteobacteria 和Actinobacteria主要在SD_D中富集，差异显著的分类群更多。Telmatospirillum（Proteobacteria）在SD_S中富集（图5d）。

在SHX混交林中，SHX_H根际细菌的物种丰富度超过SHX_S，而SHX_X的最低（图6a）。SHX_X根际细菌群落的香农指数最高，表明其根际细菌群落具有最大的多样性。前两种组分的PCA解释了根际细菌71.36%的分布（图6b）。SHX_H和SHX_X的根际细菌在根际细菌群落组成上更为相似。对于SD中不同树种，除香农指数外，SD_S根际细菌的Chao1、ACE和辛普森指数均高于SD_D，表明前者根际细菌的多样性小于后者（图7a）。PCA结果表明，来自这两组的样品显示出明显的分离（图7b）。在SHX属水平前40种细菌绝对丰度的网络分析中，SHX_S有36个节点和47个边，SHX_H有33个节点和38个边，SHX_X有32个节点和40个边（图6c）。与SHX_S相比，互作网络在SHX_X和SHX_H的复杂性和平均程度有所下降。SD_D边的数量高于SD_S，表示SD_D具有更加复杂的互作网络（图7c）。

（iii）土壤理化性质与根际土壤细菌的关系。图8展示了SHX中不同树种根际土壤性质与根际细菌在门水平上绝对丰度的相关性。pH值与Nitrospirae和Latescibacteria呈显著正相关，SOM与Bacteroidetes呈显著正相关。AN与Verrucomicrobia存在显著正相关。此外，AP与Proteobacteria、Planctomycetes和Acidobacteria，与Actinobacteria和Bacteroidetes呈极显著正相关（图8a，b）。根据RDA结果，土壤pH、SOM、SOC、TN、TP、AN和AP都会导致根际细菌群落的变化。pH和AP均显著影响SHX不同树种的根际细菌群落（图8c）。

在SD中，除BRC1外，根际土壤细菌与土壤性质没有显著相关性（图8b）。然而，TP与Nitrospirae呈强的正相关，土壤有机质与Bacteroidetes和Gemmatimonadetes具有显著的相关性。影响SD中SD_S和SD_D根际细菌群落的根际土壤养分主要为pH、SOM、TN、TP和AN（图8d）。优势菌门与SOM、TN、TP和AN呈正相关，但与pH呈负相关。

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