儿童渗出性中耳炎的微生物组成解析

发稿时间：2016-12-05来源：天昊生物

英文题目：The Microbiome of Otitis Media With Effusion

中文题目：渗出性中耳炎的微生物组成

期刊名：The Laryngoscope       

技术：扩增子测序，V3-V4区

发表时间： 2016 

研究背景

中耳炎（OME）是最常见的儿童听力损伤的原因。据统计2岁内的小孩有1/5患过中耳炎，而10岁以内的小孩有4/5都曾受到中耳炎的影响。尽管咽鼓管在中耳炎中起到重要的作用，但中耳炎的发病机制还不清楚。通过传统的培养技术分离出的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌是中耳炎最常见的发病原因。随着相关技术的不断发展，如16SrRNA焦磷酸测序，人们在中耳中检测到一些以前未知的细菌，其中一种新发现的发病菌，如耳炎差异球菌（AO）已经从中耳分泌物中检测出来。

筛选标准

中耳炎患者：具有慢性渗出性中耳炎（＞3个月）做了腺样体切除术等待气管插入的儿童。招募了1-8岁（平均年龄40个月）的23名中耳炎患者（14名男性）。

对照组患者：在过去12个月没有中耳炎历史，经历过其他形式的手术需要全身麻醉，从鼻咽部远处解剖进行过气管插管。招募了1-12岁的10名对照患者（平均年龄73个月）。

排除标准

       包括以前的腺样体切除术，急性中耳炎，无积液，手术时上呼吸道感染，手术前4周服用过抗生素或类固醇。

人口统计数据

       包括年龄，性别，和父母吸烟状况以及临床资料，包括现在的症状、以前的检测史、用药史和手术史。

样品采集和DNA提取

       中耳积液收集：包括外耳道洗耳器在内都是无菌设备。进行鼓膜切开术，使用微型吸管吸取积液，然后使用2微升的无菌生理盐水冲洗。

      腺样体拭子收集：为了避免污染，所有的拭子直视下取口样。无菌拭子被引导入口，避免与口咽粘膜接触。然后将拭子在腺样体表面刷5次并立即转移到一个内旋盖冻存管。

      所有样本取样后立即放在冰上，并转移至-80度冰箱保存。从样品中抽提细菌DNA 采用PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Salona Beach, CA)。

人口统计数据

     收集了35个中耳积液样品。对照组7名患者通过喉支气管镜检来检查软喉症，其余3名患者分别进行全身麻醉甲状腺切除术，耳前窦道修复和气道异物检查。在年龄、性别和处于同一吸烟环境的单变量分析中，两组间无显著性差异。

中耳微生物组

中耳液中的细菌主要是好氧菌，但在患者间的相对丰度差异较大（图1）。相对丰度最高的是差异球菌属和耳源属（莫拉克斯氏菌属，嗜血杆菌属和链球菌属）（表I）。

差异球菌属和嗜血杆菌的相对丰度表现出负相关（P=.049）。此外，亚组分析表明单侧积液中的差异球菌属比双侧积液中的丰度更高（P=.004， U检验）。

 

图1 中耳液中微生物的相对丰度

表1 分泌型中耳炎病人腺样体拭子和中耳液样本中的细菌相对丰度和流行度

 中耳内不同丰度微生物之间存在相关性（图2，表II）。总的来说，所有的MEF样本都含有一个核心的厌氧菌属和兼性厌氧菌属.

 

图2 中耳渗出液中细菌之间的关系图。红：厌氧菌；橙：兼性厌氧菌；蓝：好氧细菌。

圆的大小是相对于其他细菌的相关性。

表二  中耳渗出液中细菌之间的相关性。

 

同一患者的双侧积液微生物组成基本相同（图3和图4），具有双侧中耳炎的不同患者之间积液微生物组成也基本一致。常见的致病性菌属间有着较强的相关性：嗜血杆菌（P=.007），链球菌（P <0.001），葡萄球菌（P =.025）和棒状杆菌（P =.006）。

图3 不同中耳液样品相似性的聚类分析

图4 双侧中耳渗出液微生物组成的相对丰度

腺体微生物组与中耳微生物组

中耳腔中的微生物组成和腺体的微生物组成不同，但是来自中耳炎患者和对照组的腺样体拭子间的 Alpha 多样性类似（图5，表I）。丰度最高的17个细菌属中有13个在中耳液和腺体之间存在丰度差异，另外有三个细菌属（假单胞菌，肠杆菌和弯曲杆菌）只出现在中耳液样本中（表1）。这些结果是通过进行β多样性检查的PERMANOVA多变量分析和Co-occurrence模型得到的（图6）。

 

           图5  微生物种属水平基于Bray-Curtis的PCA分析

图6  Co-occurrence model模型显示不同样本类型种属水平的相对丰度

中耳炎患者腺体微生物组与对照组微生物

中耳炎患者和对照组的腺体样本在微生物多样性和相对丰度方面类似（表III）。PERMANOVA分析再次证实了这相似性。中耳炎患者腺体样本中引起中耳病的细菌（链球菌属，嗜血杆菌属和莫拉克斯氏菌属）丰度更高。此外，相同的厌氧和兼性厌氧菌在中耳炎患者中的丰度高度相关，这一现象在腺体中也是一致的。

 

结果总结

1.   中耳液中的细菌主要是好氧菌，相对丰度最高的是差异球菌属和耳源属（莫拉克斯氏菌属，嗜血杆菌属和链球菌属）。

2.   差异球菌属和嗜血杆菌的相对丰度表现出负相关。此外，单侧积液中的差异球菌属比双侧积液中的丰度更高。

3.   同一患者的双侧积液微生物组成基本相同，具有双侧中耳炎的不同患者之间积液微生物组成也基本一致。

4.   中耳腔中的微生物组成和腺体的微生物组成不同。中耳炎患者和对照组的腺体样本在微生物多样性和相对丰度方面类似。

5.   腺体样本和中耳腔的微生物群之间的差异表明：腺样垫是儿童中耳炎患者中耳积液的一个重要储层。在儿童中耳炎患者中，中耳的微环境对微生物的组成比由腺体传播到中耳的潜在致病菌起着更大作用。

关于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250测序策略对细菌16S rDNA区/真菌ITS区/真菌18SrDNA区的双V区或多种单V区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列Q30达到80%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。