[昊阅读] 肠道菌群失调导致高血压的发生

发稿时间：2017-10-19来源：天昊生物

副标题：四管齐下：宏基因组+代谢组+粪菌移植+扩增子测序！

 

英文题目：Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension

中文题目：肠道菌群失调导致高血压的发生

期刊名：Microbiome       发表时间： 2017           影响因子： 8.496

发表单位：中国医学科学院阜外医院高血压中心

技术：

l 宏基因组测序(GM) ：41名对照者（Control）、56例高血压前期患者(pHTN)、99例原发性高血压患者(HTN)的粪便样本

l 代谢组（LC/MS）：30名对照者（Control）、31例高血压前期患者(pHTN)、63例原发性高血压患者(HTN)的空腹全血样本

l 粪便移植无菌小鼠: 对照组小鼠n=5、HTN组小鼠n=10

l 受体小鼠粪便16S rRNA扩增子测序（V4）

筛选标准：所有高血压患者都是最新诊断的高血压患者，并且都没进行过降压治疗。有癌症、心力衰竭、肾衰竭、吸烟、中风、外周动脉疾病和慢性炎症性疾病的患者被排除。不能使用以下药物，包括他汀类药物、阿司匹林、胰岛素、二甲双胍、硝苯地平和美托洛尔。过去8周内不能接受抗生素或益生菌治疗。除了收缩压和舒张压外，其它临床参数在患者和对照者之间均无显著性差异（除了空腹血糖水平有差异）。

研究背景： 

最近，肠道微生物在代谢性疾病中的作用已经显露出来，尤其是在心血管疾病。高血压是世界范围内最常见的心血管疾病之一，然而肠道菌群失调是否参与高血压的发生发展仍然是未知的。为了探讨这个问题，本文对健康对照者、高血压前期患者、原发性高血压患者进行了全面的宏基因组学和代谢组学分析，并将高血压患者粪便菌群移植到无菌小鼠，观察其是否出现高血压症状。

研究结果：

1、 微生物多样性和肠型分析

稀释性曲线结果表明所测数据量已经足够发现绝大多数基因。对照组新基因速率超过疾病组新基因获取速率，提示高血压前期患者(pHTN)和原发性高血压患者(HTN)的基因丰富相对较低（图1A）。与对照组相比，PHTN和HTN组的基因数量显著性减少（图1B）。在属水平PHTN和HTN组的肠道菌群a多样性显著降低（图1C）。这些结果表明高血压患者肠道菌群减少。

196个样本分可以为两个不同的肠型（图1D）：肠型1（Prevotella）和肠型2（Bacteroides）. PHTN和HTN组具有更多比例的Prevotella肠型，而健康对照组具有更多比例的Bacteroides肠型（图1F）。

 

图1. 高血压患者微生物多样性降低，肠型发生转化

2、 与高血压相关的菌属

44个菌属在组间存在差异（图2A）。Prevotella和Klebsiella菌在PHTN和HTN组中显著增加（图2B）。Prevotella起源于口腔和生殖道，牙周病和风湿性关节炎与Prevotella相关。许多传染病认为是Klebsiella造成的。相比之下，Faecalibacterium, Oscillibacter, Roseburia,Bifidobacterium, Coprococcus, Butyrivibrio在健康人群富集（图2B）。Faecalibacterium（柔嫩梭菌）和Roseburia（罗斯氏菌）丰度下降已知与克隆氏氏病和溃疡性结肠炎发生相关，这两种细菌都是丁酸生产的关键菌。这表明Prevotella和Klebsiella菌的过度生长可能在高血压的病理中起重要作用。同时需要注意的是，高血压前期组（PHTN）已经具有与高血压组（HTN）类似的微生物群落。这表明肠道菌群变化可能早于高血压的形成。

 

图2. 各组间的差异菌属分析

3、 PHTN和HTN组中显著富集的CAG

与对照相比，分别有316和372个CAG在PHTN和HTN组得到富集。对照组中显著富集的CAG主要来自Firmicutes和Roseburia（图3A，B）；PHTN组富集的CAG主要来自Enterobacter（肠杆菌，一种与肥胖有关的致病细菌）；隶属于Fusobacterium和Klebsiella的CAG在PHTN和HTN组得到富集。

 

图3. 与对照相比，上调或下调菌类型的相关网络分析。CAG为至少包含50个连锁基因的基因簇。节点的大小表示该CAG的基因数量。节点的颜色代表了它们所属分类。斯皮尔曼相关系数值大于0.8用红色线段连接，0.7-0.8用灰色线段连接。

4、 临床指标与CAG细菌相关性分析

将临床指标包括收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、体重指数（BMI）、空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）与CAG进行Spearman相关分析。结果发现：SBP和DBP可以负调控对照组富集的CAG（例如Firmicutes、Roseburia），可以正调控pHTN和HTN组富集的Prevotella和Desulfovibrio。而TC和TG与pHTN和HTN组富集的Enterobacter呈负相关（图S6）。这些结果表明PHTN和HTN组的细菌群落很相似，这些细菌的集体效应可能与
高血压患者的肠道微生态失调相关。表明PHTN和HTN组的细菌群落很相似，这些细菌的集体效应可能与高血压患者的肠道微生态失调相关。

 

图S6. 临床指标与CAG丰度相关性分析。正相关用红色表示，负相关用蓝色表示，+: p值＜0.01；*: p值＜0.05。

5、 PHTN和HTN组菌群功能的改变

健康组和高血压组在肠道菌群基因功能上具有明显差异（图4A）。无论是KEGG modules（图4B）还是碳水化合物活性酶类（图4C），与对照组相比，PHTN和HTN组都有类似的差异，说明PHTN和HTN组肠道菌群功能很类似。39个KEGG modules在PHTN和HTN组减少，主要包括：支链氨基酸的合成运输、酮体生物合成、双组分调节系统、甲硫氨酸和嘌呤降解（图4B），这些代谢功能对宿主是必不可少的。17个KEGG modules在PHTN和HTN组升高，主要包括：LPS合成运输、磷脂运输、磷酸转移酶系统（PTS）、

苯丙氨酸和磷脂酰乙醇胺合成、分泌系统（图4B）。PHTN和HTN组的纤维素结合结构域相关基因显著富集但是glycan-utilizing enzymes相关基因显著减少（图4C）。

 

图4  PHTN和HTN组微生物基因功能注释。 A.196个样品KEGG Orthology相对丰度比较。 B.各组间肠道微生物KEGG modules的差异比较。C. 各组间肠道微生物CAZy家族丰度的差异比较。

6、 各组间肠道菌群代谢物比较分析

因为肠道菌群的代谢产物可以进入血液并可以影响宿主的生理机能，利用LC/MS对124个样本的血清进行代谢物分析，进而对肠道菌群和代谢物进行相关性分析。PLS-DA分析能把代谢物在健康组、PHTN和HTN组明显分开（图5A、B），其中PHTN和HTN组的肠道菌群代谢产物非常类似。对照组和PHTN共有167个代谢物有差异，对照组和HTN组共有215个代谢物有差异（图5C）。值得注意的是，PHTN和HTN组的代谢产物变化非常类似，这与前面的肠道菌群变化紧密相关（图5D）。3,4,5-三甲氧基肉桂酸、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、S-羧甲基-L-半胱氨酸和溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）在PHTN和HTN组明显减少。N-乙酰- L -精氨酸α、硬脂酸、磷脂酸（PA）和葡萄糖苷在在PHTN和HTN组明显增多。微生物菌群与代谢产物有相关性：对照组富集的三氯葡萄糖醛酸与Bifidobacterium、Akkermansia正相关，但是与Prevotella呈负相关。HTN组富集的Klebsiella、Prevotella、 Enterbacter与硬脂酸呈正相关，而硬脂酸与Bifidobacterium、Roseburia呈负相关。

 

图5  PHTN和HTN组的异常代谢模式。 A.不同组别血清代谢谱的PLS-DA分析。 B. 不同组别血清代谢谱的散点图分析。 C. 在PHTN和HTN组发生明显变化的代谢物。ES +：离子模式，ES−：负离子模式。D.不同组别血清代谢产物的差异比较。E. 26种内源性代谢物与44个菌属的Spearman相关性分析。对照组：绿色，高血压组：粉红色。

7、 建立识别高血压病人的的诊断模型

建立了基于CAG和代谢物的高血压疾病诊断模型，此诊断模型可以准确区分高血压患者和健康人，AUC值分别为0.91，表明此模型很准确（图6A），另外此诊断模型也可以准确区分高血压前期患者和健康人，AUC值分别为0.89（图6B）。此模型不能有效区分PHTN和HTN组（图6C）。PHTN和HTN组区别与对照组的一些CAG是共同的：例如CAG-172 (Prevotella), CAG-197(Prevotella), CAG-759 （Faecalibacterium), CAG-765(Faecalibacterium), and CAG-793 (Faecalibacterium) （图6D、E）

 

图6  建立了从对照组准确区分高血压前期和高血压患者的疾病分类器

8、 粪便移植可以导致血压升高

在这项研究中，似乎高血压的主要原因是肠道微生态失调，因此，本文想研究是否可以通过微生物移植来改变血压。因此把高血压患者的粪便移植到无菌小鼠体内，来看看这些无菌小鼠的反应。本研究的微生物移植供体包括两例高血压患者和正常血压对照者。8～10周的小鼠分为两组(对照组n=5, HTN组n=10 )，分别口服接种供体粪便样本（图7A）。喂养7天后使用通过16S扩增子测序研究受体小鼠的粪便样品。从高血压患者成功定植到无菌小鼠128个菌属。从健康对照者成功定植到无菌小鼠110个菌属（图7B）。香浓指数表明HTN组小鼠细菌多样性少（图7C）。PCoA分析表明高血压患者和对应受体小鼠菌群结构类似，而对照健康人和对应受体小鼠的菌群结构类似（图7D）。属水平上，Anaerotruncus, Coprococcus, Ruminococcus, Clostridium, Roseburia, Blautia, Bifidobasterium在HTN组小鼠较少（图7E），而Coprobacillus和Prevotella则在HTN组小鼠富集，这与前面的人宏基因组分析结果一致。移植后10周，与对照组相比，移植了HTN粪便的小鼠表现出显著较高的收缩压（SBP），舒张压（DBP）和平均血压（MBP）（图7F）。

 

图7粪便移植后的受体小鼠肠道微生物分布及血压统计。

总结：

l 与健康对照者相比，PHTN和HTN组的微生物丰富度和多样性显著下降。

l PHTN和HTN组具有更多比例的Prevotella肠型。

l PHTN和HTN组中有益菌明显降低、Prevotella和Klebsiella等有害菌过度生长。

l PHTN和HTN组中与疾病相关的微生物功能和基因显著富集。

l PHTN和HTN组的微生物和代谢产物变化非常相似，表明PHTN和HTN组的代谢产物改变与微生物组的改变密切相关。

l 建立了基于菌群和代谢物的疾病诊断模型，能准确区分对照组和高血压前期、高血压患者。

l 将高血压患者粪便移植到无菌小鼠，结果无菌小鼠血压升高。