肿瘤组织和cfDNA外显子组捕获测序 标准服务说明

发稿时间：2018-05-09来源：天昊生物

1. 服务介绍

肿瘤因体细胞突变（Somatic Mutation）积累引起。相较于常规样本中生殖突变（Germline Mutation）位点的检测，肿瘤样本因为纯度低、异质性高、突变频率低等原因，需要更高的测序深度、更优化的数据分析方法才能更有效精确地鉴定其中的突变位点。

全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES），作为大规模组学研究的常备技术，是一种利用杂交技术将全基因组外显子区域DNA捕获富集后进行高通量测序，从而鉴定并发现与蛋白质结构、功能变异相关突变的技术手段。相较于全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS），全外显子组测序更加经济、高效，在相同测序成本条件下，可以高深度地检测更多的实验样品，更为精准地鉴定常见变异以及罕见变异，高效发现全新突变。

天昊生物使用全自动核酸抽提工作站，确保样本抽提的稳定性，最大程度避免样本间污染；使用业内最优的Covaris超声基因组片段化方案，结合精心优化的文库构建体系进行DNA文库构建，最大程度地保证文库转化效率，在满足高深度测序的同时，尽可能减少珍贵实验样本的消耗；高口碑的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片，捕获效率优，目标区域覆盖均匀度高；多重保障确保肿瘤样本体细胞突变检出的灵敏度和特异性。

2. 技术优势

•   金标准：使用业界公认的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片。
• 一代验证：免费使用SNPscan®技术确保样本中高频突变检出的准确性。
•  高性价比：相较全基因组测序，相同测序量可高深度地检测更多实验样品。

3. 应用领域

多个癌种的组织或cfDNA全外显子捕获测序

4. 技术路线图

 

5. 技术参数及分析内容

 

6. 案例分析

案例1：EGFR突变的晚期肺癌患者中共现的遗传变异对进化和临床的影响

Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers

期刊：Nature Genetics

发表时间：2017年11月

影响因子：27.959

第一单位：Department of Medicine, University of California, USA

 

背景简介：关于癌症遗传学和治疗当前主要关注某一种致癌基因呈阳性的疾病，例如非小细胞肺癌中EGFR突变，但是这种方法并没有解决癌症中一些共现的遗传变异的潜在风险。那么这些共现的遗传变异究竟能达到怎样的程度，与主要的驱动基因（如EGFR）共同促进肿瘤发展和治疗抗性？本研究就提出这样的假设：共现的遗传变异普遍存在，而且与主要的驱动基因组成共驱动基因（co-drivers），从而促进肿瘤进展并且限制靶向治疗的效果。

 

研究方法：收集1122例EGFR突变阳性和1008例突变阴性的晚期肺癌患者的全血样本，对其中游离的DNA（cfDNA）进行68个临床相关的基因的外显子进行测序分析。并且对一例EGFR突变肺癌患者的7份纵向收集的样本进行全外显子测序。

 

主要结果：

1.晚期EGFR突变肺癌患者cfDNA分析：首先在EGFR突变阳性和阴性组之间发现了部分共现的突变基因，而且有显著差异（图1）。而且在440例EGFR p.Thr790Met突变阳性和682例突变阴性之间也发现了差异性的共现变异（图2）。

2.EGFR突变患者cfDNA与临床结果：对不同时期的TKI治疗患者的cfDNA进行分析发现了治疗能够诱导基因组共现变异的进化（图3）。

3.基因组纵向时空的表征分析：伴随TKI治疗和抗性的进展，在诊断期患者超过75%的编码区突变呈克隆级别，但在死亡时下降到50%-58%，同时出现了亚克隆的突变（图4）。

 

研究结论：

本研究强调了开展更多知情的及基因上授权的，包括分子诊断、监测及动态应用多种理性的治疗策略的重要性，来处理克隆和亚克隆的共现变异，从而更好地控制癌症。而且本研究所揭示的内容有助于改变当前关于对癌基因呈阳性肺癌的认识，也为基础和临床研究提供了未来的方向。

 

图1 晚期EGFR突变阳性与阴性肺癌患者间cfDNA共现的基因组变异 

 

图2 440例EGFRp.Thr790Met突变阳性和682例突变阴性晚期NSCLC患者共现的基因组变异比较

图3 EGFR突变晚期NSCLC患者cfDNA中检测到随治疗诱导的基因组共现变异的进化

 

图4 一例EGFR突变患者从诊断到死亡期间肿瘤及cfDNA纵向基因组分析

 

[1] Blakely CM, Watkins TBK, Wu W, Gini B, Chabon JJ, et al. (2017) Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers. Nat Genet 49: 1693-1704. DOI: 10.1038/ng.3990.

 

案例2：追踪非小细胞肺癌的进化发展

Tracking the evolution of non-small cell lung cancer

期刊：The New England Journal of Medicine

发表时间：2017年6月

影响因子：72.406

第一单位：The Cancer Research UK Lung Cancer Centre of Excellence

 

背景简介：英国癌症研究中心（Cancer Research UK）自2014年4月开始资助招募患者,通过治疗来追踪非小细胞肺癌的进化发展，这是一项多个中心协调进行的前瞻性群组研究，预期收集842例肺癌患者肿瘤组织样本进行高深度、多区域的全外显子测序，其目的是为了验证瘤内异质性（突变、拷贝数变异）与临床转归相关这一假设。本文对首先收集的100例患者样本进行分析。

 

研究方法：利用Illumina Hiseq技术对327个肿瘤区域（100例患者）及100例对应的全血germline样本进行全外显子测序，测序深度达到426×。

 

主要结果：

1.非小细胞肺癌瘤内异质性：30%的体细胞突变（中位数）及48%的拷贝数变异（中位数）分别被识别为亚克隆，表明在肿瘤的发展中突变和染色体水平上的基因组不稳定性过程一直在发生（图1A）。另外亚克隆拷贝数变异比例较高的患者其复发或死亡风险显著更高（P = 4.4×10⁻⁴，图1C），而亚克隆突变的比例与肿瘤复发并无显著的相关性（P = 0.70，图1B）。

2.非小细胞肺癌瘤内异质性的影响因素包括突变过程、染色体不稳定性及基因组加倍。

3.克隆或亚克隆驱动基因的改变与基因组事件的发生时间：特定癌症的基因改变主要是在克隆水平，而且在基因组复制前就会发生，这表明这些改变参与了癌症的起始（图2）。以腺癌为例，这些改变包括EGFR/MET/BRAF靶向的突变或扩增，TERT基因8p缺失及5p增加等。

 

研究结论：

通过对早期非小细胞肺癌驱动事件与克隆性之间的关系进行研究，能够发现基因组不稳定性不仅是平行进化的重要驱动因素，而且预示了较差的预后。

 

 

图1 非小细胞肺癌患者肿瘤组织的基因组异质性

 

图2 体细胞事件在非小细胞肺癌进化中的时间进程

 

[2] Jamal-Hanjani M, Wilson GA, McGranahan N, Birkbak NJ, Watkins TBK, et al. (2017) Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med 376: 2109-2121. DOI: 10.1056/NEJMoa1616288.