Nature Genetics：3’ UTR变短能够通过干扰ceRNA的crosstalk以反式作用方式抑制肿瘤抑癌基因

发稿时间：2018-08-03来源：天昊生物

 

摘要一览

由可变聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）引起的mRNA 3’ UTR变短（3’ US）是一种常见现象，它可以促进体内肿瘤生长。此前的假设普遍认为，这一过程通过顺式作用来逃脱由microRNA介导的对原癌基因表达抑制。本研究却发现，3’ UTR变短在被预测为肿瘤抑制基因的竞争内源性RNAs (ceRNAs)转录本中得到了惊人的富集。研究者基于3’ UTR变短（MAT3UTR）的反式效应模型分析揭示了其在改变ceRNA表达中的重要作用。MAT3UTR预测了许多3’ UTR变短的反式靶点，包括PTEN，它是一个关键肿瘤抑制基因，参与了9个3’ UTR变短基因（包括EPS15和NFIA） ceRNA 的crosstalk。对3’ UTR变短调节子基因NUDT21敲降后，以miRNA依赖的反式作用方式抑制了PHF6和LARP1抑癌基因的表达。综上所述，本研究结果表明，3’ UTR变短能够通过干扰ceRNA的crosstalk以反式作用方式，抑制肿瘤抑癌基因，而不是诱导顺式作用的原癌基因导致肿瘤发生的。

 

 

 

发表期刊：Nature Genetics 发表时间：2018-5-21 影响因子：27.125

 

背景介绍及研究意义

在细胞增殖和转化过程中，普遍存在着APA引起的mRNA3’ UTR变短的发生。先前人们的假设认为，变短的3’ UTR通过逃脱miRNA介导的抑制而导致顺式中原癌基因的激活。本研究挑战了这一假设，并暗示了3’ US在肿瘤发生中的不同功能，本研究有助于深入揭示肿瘤的发生机理。

 

 

可变聚腺苷酸化示意图

图片来源：https://en.wikipedia.org/wiki/Polyadenylation

 

 

研究方法

RNA-Seq、miRNA-Seq及ceRNA鉴定，RIP，qRT-PCR等。

 

研究结果

 

图1、3’ US (3’ UTR shortening)基因与癌基因没有强关联。a) TCGA RNA-Seq数据显示CCND1的3’ UTR区在肿瘤(黄色)和正常样本(蓝色)之间没有明显变化。Poly(A)-seq结果观察到类似的模式。b) 358例TCGA肿瘤/正常样本中3’ US基因(红色)和所有基因(灰色)的ΔPDUI值(上图)。负ΔPDUI表示3’ US变短。下图显示了358个肿瘤/正常样本中CCND1的ΔPDUI值。可见， CCND1 3’ UTR发生显著变短的发生肿瘤的仅展非常小的部分( 358人中有8人；2.2 % )。c）前期研究鉴定的3’US基因和癌基因之间的重叠P值及比率。

 

 

图2、3’ UTR变短干扰ceRNET（ceRNA global regulatory networks）。a）乳腺肿瘤和匹配的正常组织中随机选择100000转录本对时有显著的miRNA结合位点重叠的Pearson相关系数。b）乳腺肿瘤和正常ceRNETs中ceRNA对的数量。括号中的数字为归一化的肿瘤和正常样本之间共享边数。c）EPS15 (3’ US基因)和PTEN ( ceRNA partner )在68例雌激素受体阳性乳腺肿瘤和匹配正常样本上的基因表达。水平线代表PTEN的平均表达值，在肿瘤中出现下降(FDR = 2.1×10^-10 )。d）热图显示了68个ERP肿瘤/正常对(列)中按照3’ US基因的数量排序显著的APA(alternative polyadenylation)事件(行)。Venn图显示了正常和肿瘤ceRNET中ceRNA对的数量。括号中的数字为肿瘤和正常组织归一化后共享的边数。P值是根据单尾皮尔逊卡方检验计算结果。

 

 

 

图3、3’ UTR变短抑制TCGA乳腺癌中的肿瘤抑制基因表达。a）3’ US ceRNA hub基因(红色)、3’ US ceRNA non-hub基因(蓝色)、3’ US基因(紫色)和随机RefSeq基因(灰色)的功能富集结果。本研究随机抽样每个基因类别到相同的数量各100次；绘制了具有标准偏差的平均P值。b）3’ US ceRNAs (n = 160，左框)抑癌基因的相对表达(肿瘤/正常)低于不在ceRNET中的抑癌基因( n = 226，右框)。c）3’ US基因(左)可能通过3’UTR变短释放的miRNAs (中间)通过反式作用抑制其ceRNA伴侣PTEN表达。d）上面热图显示了9个3’ US基因(行)的APA事件。下图显示了10种肿瘤中PTEN的表达水平，其中UTR变短最多(左)或最少(右)。e）用对照(Con.)或EPS15靶向siRNAs处理的MCF细胞裂解物的Western blot分析。这幅图代表了三个独立的实验。f）为用含有PTEN 3’ UTR和EPS15靶向siRNAS的荧光素酶报告基因转染的MCF7细胞裂解物的荧光素酶活性定量结果。g）PTEN 3’ UTR荧光素酶报告基因在转染了EPS15和DICER靶向siRNAS的MCF7细胞中的活性。h）用含有载体衍生的3’ UTR (Con.)或EPS 15 3’ UTR以及GFP构建体的异源报告基因转染的MCF7细胞的间接免疫荧光。通过与Alexa Fluor - 594结合的抗PTEN抗体检测PTEN。箭头突出显示PTEN +转染的细胞。

 

 

图4、NUDT21介导的3’ UTR变短导致肿瘤抑制因子以反式作用被抑制。a) 在NUDT21敲降(KD)实验中，癌基因或抑癌基因中3’ US ceRNAs (红色)、3’ US 基因(蓝色)和RefSeq基因 (灰色)的富集情况。实验对每个基因类别随机抽取到相同的数量(n=1168) 100次，并得到标准偏差的平均P值。b）3’ US ceRNAs ( n = 57，左框)或未与3’US基因关联( n = 339，右框)的抑癌基因的表达变化。3’US ceRNA抑癌基因在NUDT21敲降样品中表达较低( P = 0.03 )。c）使用CRISPR / Cas9在HeLa细胞中敲降NUDT21的通过western blot检测。d）用AGO2抗体进行RIP实验，以正常小鼠IgG作为对照。用western blot检测RIP复合物。

 

图5、NUDT21介导的3’ UTR变短抑制肿瘤抑制基因PHF6和LARP1。a）NUDT21敲降细胞3’ US ceRNA肿瘤抑制基因(PHF6/LARP1)和3’ US基因(LAMC1/YOD1)的Western blot结果。b）在NUDT21敲降细胞和对照siRNA转染细胞中，PHF6 3’ UTR和LARP1 3’ UTR荧光素酶活性检测。c）NUDT21敲降诱导YOD1的3’ UTR变短和表达上调，使得miR-3187-3p和miR-549抑制PHF6。d），使用转染NUDT21siRNA (si-NUDT21-4)的HeLa细胞裂解物和两种阻断miR-549和miR-3187-3p的拮抗剂的western blot分析。e) PHF6 3’ UTR荧光素酶报告载体在具有siRNAs、miRNAs或拮抗剂的HeLa细胞中的活性。f）用对照siRNA或YOD1 siRNA转染的细胞裂解物的western blot分析。g）在用与f中相同的实验设计处理的细胞中PHF6 3’ UTR荧光素酶的活性。h）用siRNAs转染的细胞中PHF6荧光素酶的活性检测。

 

结论

1、通过对TCGA数据库RNA-Seq等数据挖掘发现，3’ US基因与原癌基因不存在强关联现象。

2、ceRNA可以通过反式作用形成调控网络（ceRNET）来控制生物活动进程。本研究通过对TCGA数据的分析发现3’ UTR变短可以干扰ceRNET。

3、对TCGA乳腺癌数据分析及功能验证实验表明，3’ UTR变短抑制TCGA乳腺癌中的肿瘤抑制基因的表达。

4、对3’ US关键因子NUDT21的细胞敲降实验表明，NUDT21介导了3’US ceRNA抑癌基因（如PHF6和LARP1）以反式作用被抑制。

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