又一篇文章，再次阐明微生物相对定量不可以替代绝对定量

发稿时间：2018-12-11来源：天昊生物

 

英文题目: Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa

中文题目：土壤绝对定量方法结合相对丰度能够反映微生物类群的真实变化

期刊名：Scientific Reports

发表时间：2017年

研究背景: 

微生物在几乎所有环境中的关键生物地球化学循环中起着至关重要的作用，尤其在土壤中，微生物群落具有较高的分类多样性和代谢潜力，可以作为反映主要生态过程的重要生物学指标。因此测定一些关键种群的丰度对于理解土壤中微生物群落的贡献是相当重要的。随着诸如Illumina MiSeq/Hiseq测序等高通量分子技术的迅速发展，可以容易地获得相对丰度。然而由于相对丰度表示为总样本中的相对比例，因此这种估计反映种群实际丰度的可靠性是不够的。将相对丰度与绝对细菌密度相结合来估计种群绝对丰度，是深入分析自然环境中微生物群落结构和功能的重要前提。细菌密度是微生物学中的一项基本指标，但其评价常常是单调乏味的，为了克服这一局限性，迫切需要快速、可靠的技术对各种环境中的微生物种群进行定量，特别是在生物多样性极高的土壤中。

随着与培养无关的测量技术发展，各种方法，包括细菌的直接计数、生化测量和核酸分子方法，已经被用来定量微生物的绝对数量。最近，一些研究已经比较了这些微生物定量方法。流式细胞术（FCM）和荧光显微镜（EM）是两种强有力的直接计数方法，但。流式细胞术（FCM）在计数细菌细胞数量方面比基于目视观察的荧光显微镜（EM）方法更为快速和准确。两种方法均使用各种荧光染料对细菌细胞进行染色，如4′，6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）和SYBR Green I（SYBR-I）等。三磷酸腺苷（ATP）作为所有活细胞的能量来源，几十年来一直被认为是数量估计的潜在指标，ATP测定快速、稳定、易于执行，但用于估计细菌细胞数时，应辅以FCM或EM。此外，利用16S rRNA基因特异性引物进行qPCR可作为快速灵敏的菌群定量方法。有研究比较了FCM、ATP、EM、qPCR等检测技术在饮用水、废水、活性污泥、底泥、土壤等不同环境条件下的细菌数量，几乎所有的研究都证明FCM更适合于测定细胞数量。尽管FCM和ATP都被认为是用于细菌细胞数量定量的有力测量技术，但是这两种方法需要一个土壤样品的预悬浮程序，有效分离细菌细胞是评估微生物数量的关键。然而，对于哪种处理效果最好，目前尚无定论。

对于土壤基质的状态，定义为土壤有机质活性组分总量的土壤微生物生物量可以通过提取微生物生化物质的特定组分来定量。用氯仿熏蒸法测定微生物生物质碳（MBC）的经典方法是40年前发展起来的，但至今仍被广泛应用。此外，磷脂脂肪酸（PLFA）也可以作为细菌的生物标志物，为土壤微生物的优势群落表征提供灵敏可重复测定，而同时无需培养微生物。PLFA分析与传统培养方法相比有许多优点，如准确度、定量、操作简便，以及对微生物生理状态和样品保存时间没有严格要求。然而，这些测量中存在的显著差异，如FCM和PLFA，使得用相同的标准比较微生物数量变得困难。

随着高通量核酸分子技术和微生物各种定量测定技术的发展，微生物群落的相对丰度和绝对微生物数量变得易于估算，Props等人结合高通量测序方法（16S rRNA基因）和FCM来定量冷却水系统上的微生物类群绝对丰度，其结果表明相对丰度的增加不一定与绝对丰度的增加有关。Stammler等人表明将16S rRNA基因扩增子测序技术和qPCR技术相结合，可以为肠道微生物群的结构和动力学提供新的见解。Smeet等人发明了一种在DNA提取过程中加入一个内标的方法，通过16S rRNA基因扩增子测序技术可同时测定土壤细菌数量和群落组成。然而，结合绝对数值和相对数值来揭示不同土壤生态系统中微生物群落的差异，目前仍然缺乏系统的研究。此外，不同气候的土壤有利于进行微生物群落的比较，本研究收集了青藏高原和北京松山的不同草原土壤。利用Illumina MiSeq技术对微生物16S rRNA基因片段进行测序，分析微生物群落的相对丰度。应用ATP、FCM、qPCR、PLFA和MBC等多种测量手段对所有微生物体的总数进行量化和系统比较。我们的结果表明，在微生物群落研究中，微生物物种的相对丰度不足以准确反应物种的绝对丰度，因此细菌绝对丰度的定量分析对于微生物群落的综合分析是必不可少的。

研究对象：

采集了位于青藏高原和北京松山的草原土壤，每个地点采集10个土壤样本。

研究结果：

北京和西藏草原土壤中物种的相对丰度分析

从这两个采样点的20个样本中总共获得了1118928个序列，每个样本获得24931-83244个序列，DCA分析表明，两个采样点的微生物群落结构显著不同，这已由三种非参数多变量置换分析方法(MRPP、ANOSIM和ADOIS)证实。在门水平上进一步比较微生物分类学组成表明，46个门中的24个被所有样本共享，其中9个门占每个样本序列的90%以上，北京和西藏草地细菌门类中以变形菌门和放线菌门最多（图1），其余7个门在两处均占优势，包括Acidobacteria, Bacteroidetes,Verrucomicrobia, Planctomycetes, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Cyanobacteria。

 

图1 两个采样点9个优势门的相对丰度

以95%置信区间(CI)对两个采样点之间主要门类的相对丰度和绝对丰度进行了响应率分析(图2a)，在主要门的相对丰度上，北京地区的Proteobacteria变性菌门显著高于西藏，而Verrucomicrobia疣微菌门、Planctomycetes浮霉菌门和Cyanobacteria蓝细菌门显著低于西藏（图2a）。

 

图2 北京和西藏草原主要门类相对丰度和绝对丰度(EAA)差异的响应比。在95%的置信水平下，使用响应比分析确定显著性。响应变量的95%CI不与0重叠表示显著结果，否则不显著。响应比大于零表示北京样品的丰度大于西藏样品，反之亦然。

多种方法的微生物绝对定量结果比较

因为不同微生物绝对定量方法得到的样品中微生物定量结果含有不同的单位，从而造成无法进行比较，通过换算，最终将所有微生物定量方法的定量结果全部换算为每克干土中所含细菌的细胞数或者16S拷贝数(表1)。ATP、FCM、qPCR和PLFA等定量方法的所有测试都显示出良好的重复性，但MBC方法则与其他方法明显不一致(图3)。

 

表1 不同绝对定量方法测定的土壤样品中的微生物生物量

 

图3不同测量方法得到的细菌细胞数的比较

不同地点的微生物数量比较

不同的微生物定量方法表明两个采样点之间的微生物数量显著不同(表1，图4)。通过ATP方法发现，北京采样点的细菌细胞数显著高于西藏，这与FCM、qPCR和PLFA结果相似。而MBC方法发现北京地区的细菌细胞数明显低于西藏地区，这与其他方法不一致。此外，Pearson相关分析表明，除MBC外，其它指标均与环境因子（土壤水分和TOC）显著相关，因此，MBC测量结果被排除在后续分析之外。

 

图4 比较两个采样点之间的总细菌细胞数量（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001）。

北京和西藏采样点优势物种的估算绝对丰度(EAA)

我们将四种不同方法（ATP、FCM、qPCR和PLFA）测定的总细菌数量与优势门的相对丰度（16SrRNA扩增子测序）相结合。由于北京样品的总微生物绝对细胞数明显高于西藏，因此主要门的估计绝对丰度(EAA)（EAA定义为某微生物类群的相对丰度乘以总的绝对微生物细胞数）与利用ATP测定的相应相对丰度呈现出明显不同的变化趋势 (图1和图5)。对于变形菌门Proteobacteria，北京地区样本的相对丰度和估计绝对丰度EAA均显著高于西藏地区。

 

 

图1 两个采样点优势门的相对丰度

 

图5 两个采样点优势门的估计绝对丰度(EAA)

然而，一些优势门的估计绝对丰度EAA与对应的相对丰度相比发生了显著变化，例如北京地区样本中Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi 和 Gemmatimonates的相对丰度与西藏样品无显著差异，但北京地区样本这些物种的估计绝对丰度EAA则显著高于西藏样品（图2）。此外，北京地区Verrucomicrobia和Planctomycetes的相对丰度显著高于西藏，但是其估计绝对丰度EAA则无明显差异（图2）。

 

图2 北京和西藏草原主要门类相对丰度和绝对丰度(EAA)差异的响应比。在95%的置信水平下，使用响应比分析确定显著性。响应变量的95%CI不与0重叠表示显著结果，否则不显著。响应比大于零表示北京样品的丰度大于西藏样品，反之亦然。

估计绝对丰度(EAA)与相对丰度和定量检测之间关系的概念模型

与宏观生态学一样，相对丰度的差异也不适合解释自然条件下微生物群落的真实丰度差异。在本研究中，我们将利用高通量测序方法得到的相对丰度与各种定量方法得到的绝对微生物量相结合，研究了土壤微生物群落的组成。根据我们的结果，我们提出了将相对丰度与定量结果相结合得到一个估算绝对丰度EAA的概念模型（图6）。如图6所示，在给定的群落1和群落2中(均有5个物种，每个物种一种颜色)，群落1有N个个体，群落2有M个个体，其中N大约是M的一半，计算每种颜色物种的相对丰度，同时将定量检测与相对丰度相结合可得到估算绝对丰度EAA。当仅基于相对丰度时，我们发现群落1中红色物种的相对丰度高于群落2，但把相对丰度与总微生物量结合在一起，转化成估算绝对丰度EAA后，我们发现群落1中红色物种的估算绝对丰度EAA则低于群落2。

 

图6 估计绝对丰度(EAA)与相对丰度和定量检测之间关系的概念模型

 

研究概要：

了解某些细菌类群的丰度变化，对土壤微生物学研究具有重要意义。然而，通过高通量技术观察到的相对丰度的差异可能不能准确地反映实际分类单元的丰度。本研究旨在探讨土壤微生物相对丰度分析与微生物定量方法是否存在耦合关系，对于描述不同地区土壤微生物种群分布是否更有意义。本文采用16S rRNA高通量测序技术分析了北京和西藏草原土壤微生物群落中主要物种的相对丰度，并采用三磷酸腺苷（ATP）、流式细胞术(FCM)、定量实时PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFA）和微生物量碳（MBC）等多个与培养无关的技术直接或间接地定量细菌的绝对细胞数，通过对土壤微生物群落中主要组分的相对丰度和绝对丰度(EAA)的比较,发现Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Chloroflexi,Gemmatimonates， Planctomycetes等优势菌门的相对丰度和绝对丰度(EAA) 表现出明显不同的变化趋势。这些结果表明EAA的变化在描述群落中种群的动态方面可能更具有信息性。土壤微生物的进一步研究应该结合微生物群落的绝对数量和相对丰度来进行不同地点的比较，因此细菌的绝对定量分析对于微生物群落的研究未来是非常重要的。

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