浅谈：论微生物绝对定量VS相对定量的优越性

发稿时间：2019-03-06来源：天昊生物

    

●当前常规细菌16S扩增子测序方法能解析样本中的物种组成和其相对丰度信息，因此对微生态研究具有重要的促进作用。然而我们需要注意一点，那就是相对丰度并不能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异，这是为什么呢？这是因为由于常规细菌16S扩增子测序每个样本之间对应的 reads 数量差距较大，为避免因样本数据大小不同而造成分析时的偏差，需对每个样本进行随机抽平处理，一般选择测序样本中最少 reads 数作为基数， 即将所有样本的 reads 数统一抽平到该值， 因此抽平处理使相对丰度分析忽略了不同样本之间总体微生物量存在的现实差异，造成了分析结果的偏差，而绝对定量分析则是计算样本每种微生物的拷贝数，从而实现绝对定量，因此绝对定量分析能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异，因此绝对定量分析相对于相对定量分析更能反映样本细菌群落的真实变化，是进行微生态研究的首选，下面小编就拿几篇研究文章的结果举例证明。

 

文章一  微生物绝对定量分析真正将肠道菌群变化与微生物载量联系起来

 

英文题目: Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load

中文题目：微生物绝对定量分析真正将肠道菌群变化与微生物载量联系起来

期刊名：Nature

发表时间：2017年

支持证据：

• 为了证明绝对定量数据（QMP）在临床研究中的潜在作用，我们对29例克罗恩病患者和健康人的样本进行绝对定量数据分析。流式细胞仪分析表明，克罗恩病患者粪便样品中的细胞数比健康对照组低3倍（图4a）。
• 发现只在应用相对数据RMP分析时，类杆菌Bacteroides才与克罗恩病相关（图4b左），仅在使用绝对定量数据QMP时，普雷沃菌属Prevotella才在克罗恩病患者中发现显著降低（图4b右）。
• 以上这些观察强调了相对数据（RMP）分析的局限性：来源于相对数据（RMP）分析的一个错误结果解释可能提示类杆菌Bacteroides在克罗恩病的发病或发展中的假因果关系，为什么会出现这种假因果关系，这是因为相对定量分析忽视了健康对照和克罗恩病患者肠道微生物总丰度的巨大差异（差3倍），通过人为抽平处理认为样本间微生物总丰度一致，从而造成上述错误，因此本文认为只有绝对定量数据（QMP）分析鉴定到的微生物总丰度降低才是引起克罗恩病患者肠道微生物结构发生改变的根本原因。作者认为目前大多数对于肠道微生物菌群结构的研究并不能体现出具体微生物数量改变对宿主带来的影响，这些相对比例研究忽略了总体微生物丰度本身的改变可能是引起宿主产生疾病的主要原因这一可能性。所以，为了真正体现宿主-微生物群的相互作用，微生物群的研究必须将比例变成绝对量。

 

图4. 克罗恩病的微生物数量变化

 

文章二  微生物类群丰度的绝对定量

 

英文题目: Absolute quantification of microbial taxon abundances

中文题目：微生物类群丰度的绝对定量

期刊名：The ISME Journal

发表时间：2017年

支持证据：

• 本研究对核试验反应堆上运行的冷却水回路系统进行两次40天调查（survey1和survey2），包括冷却水系统没有运行的时间段（control），冷却水系统启动阶段（start-up），冷却水系统稳态运行阶段（operation）。
• 仔细检查了两个微生物分支betI-A分支和bacI-A分支的释相对丰度和绝对丰度的时间轨迹时间轨迹（图2）。结果检测到两个主要差异：1）：在群落成长期间，比如survey 1的start-up和早期 operation阶段，绝对丰度有一个明确的过渡，显示出bacI-A分支的生长和衰变；相反，在生长和衰变过程中，bacI-A分支的相对丰度则始终保持相对恒定，没有任何过渡。2）：在survey2的operation后半部分，相对丰度曲线显示从±40%增加到90%以上，暗示了betI-A分支的生长；相反，如果看绝对丰度，那么这个分支就没有明显的活跃生长，其细胞密度从未显著超过start-up阶段结束时观察到的最大密度。◆
• 本文认为微生物某一类群的富集（相对丰度比例的增加）不一定真正与相应微生物类群生长（绝对丰度的增加）有关，可能是其它微生物类群的衰退导致了其在群落结构中相对丰度比例的增长。◆

 

图2 对在核试验反应堆上运行的二级冷却水回路进行两次时间分离的40天调查期间，2个最丰富的微生物淡水分支(bacI-A(OTU2，红色；OTU3，橙色)和betI-A(OTU1，蓝色))的时间动态图。top panel显示从扩增子测序数据中推断的相对丰度（in%），bottom panel显示绝对OTU丰度（单位为细胞/μl）, 圆形标签表示微生物群落的总细胞密度（单位为细胞/μl±s.d）。最下方灰色区域表示冷却水系统没有运行的时间段（控制阶段），绿色区域表示启动，蓝色区域表示稳态运行。

 

文章三  土壤绝对定量方法结合相对丰度能够反映微生物类群的真实变化

 

英文题目: Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa

中文题目：土壤绝对定量方法结合相对丰度能够反映微生物类群的真实变化

期刊名：Scientific Reports

发表时间：2017年

支持证据：

•  本文采用16S rRNA高通量测序技术分析了北京和西藏草原土壤微生物群落中主要物种的相对丰度，并采用三磷酸腺苷（ATP）、流式细胞术(FCM)、定量实时PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFA）和微生物量碳（MBC）等多个技术直接或间接地定量细菌的绝对细胞数。然后将两者相结合计算估计绝对丰度(EAA) （EAA定义为某微生物类群的相对丰度乘以总的绝对微生物细胞数）。
• 通过对土壤微生物群落中主要组分的相对丰度和绝对丰度(EAA)的比较，发现一些优势菌门的相对丰度和绝对丰度(EAA) 表现出明显不同的变化趋势：例如北京地区样本中Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi 和 Gemmatimonates的相对丰度与西藏样品无显著差异，但北京地区样本这些物种的估计绝对丰度EAA则显著高于西藏样品（图2）。此外，北京地区Verrucomicrobia和Planctomycetes的相对丰度显著高于西藏，但是其估计绝对丰度EAA则无明显差异（图2）。

 

图2 北京和西藏草原主要门类相对丰度和绝对丰度(EAA)差异的响应比。在95%的置信水平下，使用响应比分析确定显著性。响应变量的95%CI不与0重叠表示显著结果，否则不显著。响应比大于零表示北京样品的丰度大于西藏样品，反之亦然。

• 根据结果，本文提出了将相对丰度与定量结果相结合得到一个估算绝对丰度EAA的概念模型（图6）。如图6所示，给定的群落1和群落2中均有5个物种（每个物种一种颜色)，群落1有N个个体，群落2有M个个体，其中N大约是M的一半，计算每种物种的相对丰度，同时将定量检测与相对丰度相结合可得到估算绝对丰度EAA。当仅基于相对丰度时，群落1中红色物种的相对丰度高于群落2，但基于估算绝对丰度EAA时，群落1中红色物种的估算绝对丰度EAA则低于群落2。因此本文认为，与宏观生态学一样，相对丰度的差异也不适合解释自然条件下微生物群落的真实丰度差异。

 

图6 估计绝对丰度(EAA)与相对丰度和定量检测之间关系的概念模型

 

各位看官读完上述文章如果有想做微生物绝对定量的想法，那就请联系天昊生物吧，天昊生物是国内唯一一家提供 “微生物16S扩增子绝对定量测序”技术的服务商，。该方法通过向样品DNA中添加一定量外标序列，进行16S扩增子文库构建、测序，再根据外标序列的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线，计算出样品中OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数。该方法是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S扩增子测序技术合二为一的技术，该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析和环境因子分析等常规扩增子测序分析，而且可以解析样本中总细菌和特定菌种的绝对拷贝数， 最大限度地便利了广大微生态研究者。热烈欢迎各位老师与我们交流沟通微生物绝对定量相关方面的问题~