mSystems：自闭症儿童肠道谷氨酸代谢的变化与肠道微生物组成变化相关

英文题目: Alterations in Gut Glutamate Metabolism Associated with Changes in Gut Microbiota Composition in Children with Autism Spectrum Disorder

中文题目：自闭症儿童肠道谷氨酸代谢的变化与肠道微生物组成变化相关

期刊名：mSystems

影响因子： 5.750

发表单位：复旦大学附属儿科医院

研究摘要: 

肠道微环境的变化可能影响自闭症谱系障碍（ASD）的发病机制。在这里，我们调查了自闭症儿童肠道微生物和代谢物的组成。92名自闭症儿童（ASD）和42名典型发育（TD）的年龄匹配儿童被纳入了两阶段研究。在发现阶段，对43名ASD组儿童和31名TD组儿童的粪便样本同时进行了宏基因组测序和液相色谱-质谱（LC-MS）分析，以确定与肠道微生物群组成改变相关的肠道代谢产物。在验证阶段，使用LC-MS分别对ASD组（49名）和TD组（11名）儿童进行代谢物检测。ASD组的谷氨酸代谢产物发生了改变，伴随2-酮-谷丙二酸含量下降与谷氨酸代谢相关的微生物数量增多。谷氨酸代谢的这些变化与较低水平的Bacteroides vulgatus和较高水平的潜在有害Eggerthella lenta，Clostridium botulinum有关。ASD组的肠道皮质醇水平较低，与肠道微生物谷氨酸代谢的变化有关。最后，肠道2-酮-戊二酸被证实是一种潜在的ASD生物标志物。自闭症患儿肠道微环境的显著变化可为自闭症的病因提供新的认识，并有助于寻找诊断和治疗方法。

研究背景: 

自闭症谱系障碍（ASD）影响美国2.24%的3-17岁儿童，目前尚无可行的实验室诊断或有效的治疗方法。多种证据表明，肠道微生物群可能通过“肠-脑”轴在ASD发病机制中发挥重要作用，在ASD患者中，通过粪便微生物群移植（FMT）启动的肠道环境变化可改善ASD的核心症状。事实上，在临床试验中，18例ASD患者进行开放式粪便移植后，18例患者中有16例（88.8%）的胃肠道问题有显著改善，ASD的核心综合征也显著改善。在肠道代谢产物异常的ASD小鼠模型中，粪便移植可以纠正代谢产物异常并改善这些小鼠的行为异常。越来越多的研究表明，肠道代谢物在ASD中也起着重要作用。例如，ASD小鼠模型显示代谢物4-乙基苯酚硫酸盐水平显著增加，可通过Bacteroides fragilis降低代谢物4-乙基苯酚硫酸盐水平，而其它肠道代谢物，如源自微生物群的短链脂肪酸，可调节血-脑屏障通透性并影响动物行为。这些研究表明，ASD患者肠道微环境的变化可能在疾病的发病机制中发挥重要作用。然而，目前的研究大多集中在了解这些患者肠道微生物群的分类组成，很少同时探讨肠道代谢产物的组成。因此，同时研究自闭症患者肠道微生物群和代谢产物的组成对我们了解自闭症的病因至关重要。在本研究中，从患有自闭症或有典型发育（TD）的儿童身上采集粪便样本，并进行宏基因组测序和液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学分析，以确定与自闭症相关的肠道代谢产物和微生物组成。

研究结果：

受试者特征

共有92名患有自闭症的儿童和42名典型发育（TD）儿童参加了本研究。人口统计信息和统计分析如表1所示。

表1研究对象的人口统计学和临床特征

研究设计和分析流程图如图S1所示。研究分为两个阶段：在发现阶段进行了肠道宏基因组和代谢组学研究，其中ASD组43例，TD组31例；在验证阶段，额外的49名ASD儿童和11名TD儿童被纳入代谢组研究。

图S1 研究设计流程图

ASD的肠道宏基因组组成

比较ASD组和TD组儿童肠道微生物alpha多样性，结果发现，与TD儿童相比，自闭症儿童的肠道微生物物种丰富度显著降低（图1a）。为了确定各组的肠道微生物群是否能有效区分，进行了主成分分析（PCA）。PC1和PC2分别解释了6.5%和5.43%的变化，此外，PC2可以有效地区分患有ASD和TD的儿童（图1b）。接下来研究了肠道微生物群在分类和功能水平上的差异，发现ASD组儿童的Actinobacteria水平明显高于TD组儿童（图1c）。Actinobacteria中的Eggerthella lenta丰度与PC2呈显著负相关（图1d）。

 图1 ASD患儿肠道微生物组成改变

为了解ASD组和TD组儿童肠道微生物群结构和功能组成的差异，进行了MWAS分析，发现19个显著不同的分类群：与TD组相比，ASD组儿童的11个分类群明显更高，包括3个 Clostridium类群,2个 Eggerthella 类群, 2个 Klebsiella类群，ASD组儿童的8个分类群显著低于TD组。在14个显著不同的功能途径中，ASD组的11个明显高于TD组，包括与苯甲酸盐降解和酪氨酸代谢相关途径。ASD组的3个途径明显较低，包括与D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢和神经递质代谢相关的途径。

为了进一步了解这些肠道微生物群组成差异的生物学意义，进行了相关和回归分析。正如预期的那样，肠道微生物群分类和途径的差异是相关的，值得注意的是，ASD患儿潜在有害的高丰度Clostridium botulinum和Eggerthella lenta以及低丰度Bacteroides vulgatus与D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢（图S3a）、芳香族氨基酸代谢途径：苯甲酸盐降解（图S3b）、萘降解（图S3c）和酪氨酸代谢途径（图S3d）相关：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢与Bacteroides vulgatus, Eggerthella lenta DSM 2243呈正相关，与Clostridium botulinum Ba4 strain 657呈负相关；苯甲酸盐降解（b）、萘降解（c）和酪氨酸代谢途径（d）与Bacteroides vulgatus呈负相关，与Eggerthella lenta DSM 2243, Clostridium botulinum Ba4呈正相关。

图S3自闭症儿童肠道微生物群分类与功能的相关性

ASD的肠道代谢组分

为进一步了解自闭症患儿肠道微环境的组成，采用LC-MS/MS进行了粪便代谢组分分析，共检测到297种代谢产物，其中阳性（ESI）和阴性（ESI）分别检测到123种和174种。PCA分析表明，PC1和PC2能够分别解释9.87%和6.78%的变异，ASD和TD组的儿童可以根据代谢物（图2a）进行区分。通过对肠道代谢组数据集进行MWAS分析，结果发现ASD组和TD组共有31种显著差异代谢物，其中14种在ASD组儿童中明显较高，包括两种胆汁酸衍生物牛磺胆酸和3-硫酸鹅去氧胆酸，剩余17种代谢物在ASD组显著较低。为了解释这些差异的生物学意义，进行了代谢路径丰富度差异分析，结果发现，ASD患儿中明显较低的代谢物（包括三种代谢物：2-酮-戊二酸、L-天冬氨酸和富马酸）与丙氨酸（Alanine）、天冬氨酸（Aspartate）和谷氨酸（Alutamate）代谢途径有关（图2b）。因此，肠道微环境中代谢物的减少主要影响丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢，并意味着神经递质代谢的改变。

图2自闭症患儿肠道代谢组分的变化与肠道微生物群的变化显著相关

肠道宏基因组-代谢组学关联

为了了解肠道代谢物中的重要变化是否与自闭症儿童肠道微生物群组成有关，首先对31种不同代谢物和宏基因组成分（PC1/2）进行回归分析，发现大约一半（16/31）的代谢物与PC1/2显著相关，这可能意味着肠道代谢物的变化与肠道微生物群组成的变化有关。此外，还将不同的代谢产物与不同的宏基因组成分联系起来，结果表明，大多数代谢产物不仅在分类水平上与肠道微生物群组成相关（图S4），而且在功能水平上也与肠道微生物群组成相关（图2c）。有趣的是，肠道微生物谷氨酸Glutamate代谢的减少与肠道激素11-deoxy PGF2的改变有关，而肠道激素皮质醇Cortisol的改变与潜在有害细菌Eggerthella lenta DSM 2243增加有关。此外，还发现自闭症儿童肠胃中的芳香族Aromatic代谢发生了改变,芳香族Aromatic代谢的改变与肠激素皮质醇Cortisol有关，与Bacteroides vulgatus和Bacilli数量的变化有关。

图S4 ASD和TD儿童的差异肠道代谢产物和差异微生物具有相关性

图2c 不同代谢产物与肠道微生物功能途径有关

ASD和TD儿童的饮食模式无显著差异。评估了重要临床表型（如胃肠道问题GI problems和性别gender）对核心物种分类群和代谢物的影响，发现胃肠道问题与Bacteroides vulgatus, Eggerthella lenta, Clostridium botulinum, 2-keto-glutaramic acid, cortisol的存在没有关联。同样，性别对核心分类群和代谢物的存在也有有限的影响。

最后，为了进一步验证不同的肠道代谢产物是否是自闭症的潜在生物标志物，从49名自闭症儿童和11名TD儿童中收集粪便样本，并使用LC-MS/MS和系统代谢组学分析进行差异检测，结果发现，与发现阶段一样，参与谷氨酸代谢的代谢物（如2-keto-glutaramic acid，2-酮基-戊二酸）在自闭症儿童肠中明显较低（图3c和d）。

图3肠道2-酮基-戊二酸是ASD的潜在标志物。（a）较高水平的肠道2-酮-戊二酸与较低含量的肠道微生物群有关，这些微生物群与D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢途径有关。（b）较低含量的Bacteroides vulgatus与较低水平的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢途径显著相关。（c和d）在发现和验证阶段，肠道2-酮-戊二酸的水平分别显著降低。

综上所述，患有自闭症的儿童肠道代谢物成分变化与肠道微生物群组成变化有关。基于关键肠道代谢产物和肠道微生物的假设机制如图4所示。简言之，发现患有自闭症的儿童在肠道中芳香化合物、谷氨酸代谢途径和胆汁酸代谢方面存在异常，这些变化与较高数量的Eggerthella lenta细菌和Clostridium botulinum以及较低数量的Bacteroides vulgatus有关，这些发现有助于基于肠道微生物和代谢产物开发诊断自闭症的新方法。

图4  参与ASD发病机制的肠道途径和代谢产物示意图。自闭症患儿肠道微环境以谷氨酸（glutamate）代谢改变为特征，谷氨酸代谢改变与较低数量的Bacteroides vulgatus有关，Bacteroides vulgatus是一种具有谷氨酸代谢的物种，可直接影响神经递质抑制/兴奋性失衡。患有自闭症的儿童还表现出肠道代谢物的变化，如较低水平的芳香化合物（aromatic compounds）和较高水平的胆汁酸（bile acids），这与较高含量的Eggerthella lenta和Clostridium botulinum有关。患有自闭症的儿童还表现出应激激素皮质醇（cortisol）水平的改变，这意味着通过下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴对肠道微生物群的影响。

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