专属含PCR抑制剂的环境样本微生物拷贝数定量的最佳解决方案!

发稿时间：2019-06-04来源：天昊生物

腐植酸（Humic acid，HA）是动植物遗骸，主要是植物的遗骸，经过微生物的分解和转化，以及地球化学的一系列过程造成和积累起来的一类有机物质。它的总量大得惊人，数以万亿吨计。江河湖海，土壤煤矿，大部分地表上都有它的踪迹。由于它的广泛存在，所以对地球的影响也很大，涉及到碳的循环、矿物迁移积累、土壤肥力、生态平衡等方面。

 目前很多学者使用qPCR对环境样本（例如土壤，水体和淤泥）中的微生物数量进行绝对定量，但是研究发现腐殖酸广泛地存在于以上环境样本中，无论是基因组抽提前去除样本中的腐殖酸还是在基因组抽提后去除基因组中残留的腐殖酸都是很难将这些腐殖酸完全去除，这些残留的腐殖酸会通过抑制酶的活性抑制PCR，从而影响qPCR结果的准确性, 最终影响样品中微生物数量的定量结果。

基于此，本测试通过研究不同微生物定量方法（qPCR绝对定量技术和天昊生物微生物16S扩增子绝对定量测序技术）在有PCR抑制物（腐殖酸）存在的情况下，对样本中微生物数量的定量准确性的影响。

实验设计

1、 样本：

• 类型1：将9种购买的标准菌株DNA按一定比例混合，标记为标准菌株DNA（S）
• 类型2：土壤样本，标记为标准菌株DNA（T）

2、 PCR抑制剂：

• 添加不同浓度腐殖酸（HA）至反应体系中， HA 终浓度分别为 0ng/ul、10ng/ul、30ng/ul、50ng/ul；

表1 样本信息说明

3、 实验设计：

•  添加不同浓度腐殖酸条件下进行qPCR绝对定量实验，计算样品的总细菌16S拷贝数；
• 添加不同浓度腐殖酸条件下进行微生物16S扩增子绝对定量测序实验，计算样品的总细菌16S拷贝数；

4、 实验目的：

• 探究腐殖酸对qPCR检测细菌拷贝数的影响；
• 通过比较两种方法计算的样品总细菌拷贝数结果，探究在PCR抑制物存在的情况下，两种方法的适用性；

实验结果

 腐殖酸对qPCR检测细菌拷贝数的影响 

• 根据测试结果可知，腐殖酸对qPCR 反应确实具有抑制作用，这与腐殖酸是一种 PCR 抑制剂的结论一致；
• 当 qPCR 反应体系中腐殖酸终浓度为 50ng/ul 时，抑制作用非常明显；
•  因此若环境样本中含有高浓度腐殖酸时，qPCR 计算的样本拷贝数将与真实值存在较大偏差。

图 2  添加不同浓度腐殖酸条件下qPCR检测标准菌株DNA和土壤DNA样本的总细菌16S拷贝数

16S扩增子绝对定量测序和 qPCR检测细菌拷贝数时腐殖酸的影响对比

• 通过qPCR技术，无论是标准菌株DNA或土壤DNA样本，反应体系中腐殖酸终浓度为50ng/ul时，与不加腐殖酸的对照组相比，得到的两组数据结果具有明显差异；
• 通过天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术，反应体系中腐殖酸终浓度为50ng/ul时，与不加腐殖酸的对照组相比，得到的两组数据结果无显著差异；
• 造成以上结果的原因是：qPCR进行细菌拷贝数定量时，构建标准曲线的标准品不含有腐殖酸而样本则含有腐殖酸，并且两者在两个样本孔中分别进行各自的PCR反应，所以PCR反应效率不同，因此定量结果会有偏差。而天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术进行细菌拷贝数定量时，构建标准曲线的标准品和样本DNA是在同一个样本孔中一起进行PCR反应，所以PCR反应效率相同，因此校正了腐殖酸对PCR的影响，避免了腐殖酸等PCR抑制物对样品细菌16S拷贝数定量的影响。

图 3  16S扩增子绝对定量测序和qPCR检测细菌拷贝数时腐殖酸的影响对比

实验数据总结

• 综合以上数据结果，当环境样本中在有腐殖酸等PCR抑制物存在的情况下，天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术计算得到的样品细菌16S拷贝数更准确，更适用。
• 天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术是针对含PCR抑制剂环境样本中微生物拷贝数绝对定量的最佳解决方案。 

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客户合作情况

作为国内唯一一家提供 “微生物16S扩增子绝对定量测序”技术的服务商，我们首先感谢客户的信任和选择，目前微生物16S扩增子绝对定量测序技术平台已经完成项目近百个，合作的单位包括中国科学院南京土壤研究所、中国科学院水生生物研究所、上海市环境科学研究院、厦门大学环境与生态学院、中国农业大学、南京农业大学、东北农业大学、重庆市农业科学院、盐城工学院、南京财经大学、南京中医药大学、武汉大学中南医院、新疆医科大学公共卫生学院、温州医科大学、山东大学齐鲁医院等多个单位，覆盖环境微生物和肠道微生物等领域。

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