水生环境中的重金属（HMs）主要影响鱼类，因此鱼类是便捷的污染生物指示剂。此研究调查了重金属（HMs）28天内混合物（铬（Cr）、镉（Cd）、铜（Cu））在0-3.2mg/L浓度范围内对鲤鱼的毒性作用。对重金属积累，组织病理学，氧化应激和肠道微生物变化进行了评估。 HMs的积累顺序为Cr>Cu>Cd，主要在肾脏，最后是鳞片。直到第14天，所有暴露组中活性氧的产生均增加，最大产生量为3.2 mg / L混合物，后来在第28天下降。丙二醛和超氧化物歧化酶水平从第7天到第28天随着重金属（HMs）浓度的增加而增加，而总蛋白则呈相反的趋势。鳃组织病理学改变主要表现为初级板层隆起、解体、次级板层缩短。肾脏表现为肾小球坏死、鲍曼囊扩张和肾小管间隙扩张。在0.8mg/L和3.2mg/L处理组中，Proteobacteria和 Firmicutes的丰度分别增加了59.4%和99.16%。本研究对多重重金属（HMs）胁迫下鲤鱼的生理和肠道菌群的变化有了更深入的了解。
鱼类养护与实验鱼的选择：
从甘肃省兰州市当地鱼市场购买了150多个鲤鱼标本，这些标本是从黄河（YR）的不同位置采集的。使鱼在自然光周期（光照14小时/ 10小时黑暗周期）和环境温度（20-25°C）下在玻璃水族箱中适应至少两周。鱼的重量和长度分别在25-40g和12-15cm之间。在整个适应过程中，每天用自来水更新水箱中50％的水，并连续通气（pH = 8.12，溶解氧（DO）= 5.7 mg / L，总溶解固体= 346.4 mg / L，盐度= 236 mg / L，电导率= 481.4 µS / cm）。用商业食品饲料（含有海藻粉、新鲜鱼粉、虾粉、小麦面筋和大豆圆酵母；粗蛋白：26%；粗纤维：8%；水分：10%；维生素：450毫克/千克），每天两次（12:00和6:30）。喂食前使用ICP-OES确认没有重金属（HMs）。每天监测水质pH值、溶解氧和温度。选择健康鱼（未患病）进行下游实验，通过一般外观（如颜色、皮肤光泽、眼睛和行为）确认。
重金属暴露实验装置：
适应两周后，鱼被分为5组（n=10）在5个不同的50L水箱中。4组添加了重金属（HMs）混合物，剩余一组作为对照（不加HMs）。分析了从5个不同位置收集的黄河水样品，以选择本研究的HMs类型和浓度范围。使用以下HMs和浓度：0 mg / L（对照），0.05 mg / L，0.2 mg / L，0.8 mg / L和3.2 mg / L K2 Cr2 O7，CdCl 2和CuSO4 . 5H2O。三种HMs中Cu的浓度最低（0.049mg/L），最高的是Cr（2.86mg/L）。每天，用含有相应HMs浓度的自来水替换水箱中50%的水，以保持重金属（HMs）水平并确保适当的水质。在整个实验过程中，每天监测pH值、溶解氧和温度。
检测组织中的重金属：
将鱼饥饿至少24 h，然后在冰上麻醉，解剖前记录其长度和重量。每组中的三条鱼在每个时间点被处死。在进一步分析之前，所有被解剖的鱼组织都储存在−20°C的温度下，然后将组织首先冻干，在80°C下干燥过夜，随后称重肌肉、皮肤、鳞片、肠、鳃和肾脏样本，并用4.5 mL浓硝酸和0.5 mL过氧化氢溶液（30%）预消化过夜，然后将样品在蒸煮器中于175°C进一步消化2小时，随后冷却，过滤提取物，并使用Milli-Q纯水将体积提高至25 mL，采用电感耦合等离子体发射光谱法检查制备样品中的HMs（Cr、Cd和Cu）。
组织病理学变化和氧化应激检测：
察鳃和肾组织的组织病理学变化和氧化应激。解剖组织用4%中性缓冲甲醛溶液固定，光镜观察。固定后（至少18-24小时），将组织在梯度乙醇溶液中脱水并植入石蜡中，用旋转切片机切割6μm厚的细切片，放置在玻片上，用苏木精和伊红（HE）染色，用DPX固定。为了测定氧化应激，测定活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和总蛋白（TP）活性，收集组织并在−80°C下立即保存在2 mL离心管中，直到进一步分析，样品在0.89%冰盐水中均质，然后在12000×g下离心20min，样品上清液用于ROS、SOD、MDA和TP生化分析：简而言之，使用2ʹ，7ʹ-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）荧光探针在发射波长530 nm和激发波长485 nm处监测ROS的产生；用羟胺法测定超氧化物歧化酶（U蛋白/mg）活性；采用2-硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA（nmol-protein/mg）；以牛血清白蛋白为参考标准，考马斯亮蓝G-250测定TP（g蛋白/L）。
高通量测序：
从每个水箱收集肠，并混合成一个样本，分别在第7、14和28天收样。从对照组、0.8 mg/L和3.2 mg/L水箱中收集样品，将样品转移到含有磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH=7.4）的2mL高压灭菌管中，在−80°C下储存，使用DNeasy Blood & Tissue kit（Illumina，USA）提取DNA，然后进行16S扩增子测序（V3-V4）。
鲤鱼对重金属（HMs）的吸收及由此引起的危害极为敏感，因此可以作为一个合适的污染指标。高浓度下的HMs吸收（0.8 mg/L和3.2mg/L）引起严重的组织损伤、活性氧生成和肠道微生物群失调，影响其健康和生存。HMs暴露引起的肠道微生物群失衡可能是导致观察到致死性的主要原因之一。Cr是最大吸收的重金属（HMs），因此可能是中毒和肠道菌群变化的主要因素。本研究将进一步提供一个深入的研究范围，以了解肠道微生物群与应激源竞争的机制，以维持肠道功能和鱼类健康。人类食用受重金属污染的鱼类会导致重金属在人体内的累积，导致类似的负面生理效应，并可能导致死亡。因此，重金属污染的鱼类需要在人类食用前进行处理。
鱼类组织对重金属的吸收
暴露于Cr、Cd、Cu的混合物会导致鱼类的异常行为，如食物排斥、粪便排泄减少、缺乏游泳协调性、向水面移动、鳃盖快速但不规则的移动、以及一侧持续静止不动。这些行为在3.2mg/L组是极端明显的，实验18天后，该组的死亡率为100%，这种行为可能是神经元活动受到抑制的结果。肠道微生物群的变化可能会改变鱼类的生长、健康、性能、饲料效率和饲料转化率。与对照组相比，各暴露组的重金属（HMs）累积量有显著差异。鱼的HMs在第28天的累积顺序为Cr>Cu>Cd，并经常以鱼中的肾脏>腮>肠>皮肤>肌肉>鱼鳞的形式积累（图1）。据报道，食用鱼类中HMs的允许限量为：1 µg / g Cr，30 µg / g Cu和0.5 µg / g Cd。在第28天，暴露组的三个HMs都大大超过了允许的限值（图1C、F、I、L、O和R）。HMs在鱼类组织中的积累程度受鱼类类型（年龄、属和体重）和栖息地、水中金属类别、水状况（温度、透明度和pH值）、溶解氧丰度和生理条件的调节。虽然不同器官/组织的吸收不同，但鱼体内金属的主要进入途径是鳃，鱼类可以通过摄入的饲料和悬浮在水中的颗粒固体、通过亲油性组织进行离子交换和皮肤吸附来吸收HMs。Cr在所有组织中的吸收量最大，其次是Cu 和Cd（图1）。因此，Cr的过度沉积对人类食用此类鱼类造成了非常高的风险。与Cu 和Cd相比，高浓度Cr吸收主要有两个原因：1）Cr更容易被吸收，因为它是一种强氧化剂，有更强的穿过细胞膜的倾向；2）pH值在6到8之间强烈影响生物利用度、敏感性和鱼类对Cr（VI）的吸收。pH值7.8和6.5分别更适合Cr在内脏和鳃中的积累，在这项研究中，水的pH值保持在7到8之间（图S1）。Cu是哺乳动物和鱼类必需的微量营养素（5-20 µg / g），但浓度过高会导致毒性，肠道中的Cu浓度在第14天和第28天达到0.02 mg / L的峰值（图1K和L），因此可能没有表现出显著的毒性作用。除鳃在高浓度下（图1 M、N和O），Cd在所有部位的吸收最少，这与别人观察到斑马鱼鳃中Cd积累较多的研究相似。
肾脏样品中的HMs积累经常是最高的（图1P和Q），因为它是使污染物排毒以减轻有害影响的器官。肾脏在第28天的累积水平略有下降，这可能是由于HMs引起的肾脏损伤。因此，与Cu和Cd相比，Cr是吸收最活跃的HMs。
图1 暴露7、14和28天时，肌肉、皮肤、鳞片、肠道、鳃和肾脏对重金属的吸收。
鳃和肾脏的组织病理学变化
与对照组相比，HMs混合物对鳃和肾脏的损害作用显著，基本上是在暴露14天和28天后（图2）。对照组鳃的组织病理学分析显示正常，其特征是存在初级板层（PL）、次级板层（SL）和层间层（IL）。与此相反，暴露组的鳃有组织异常，包括初级板层融合、初级板层剥离和隆起、血管损伤、层间层变薄、充血、次级板层缩短和组织破裂，这表明广泛的组织损伤（图2）。在0.05 mg / L组中，直到第14天变化并不十分明显，但在第28天损害明显（图2B）。在0.2 mg / L组中（图2C），与0.05 mg / L组相比，变化更为明显，并且在第28天更为离散；在高浓度下，变化更为明显，在第28天，这种损害在0.8 mg / L组中普遍存在（图2D）；而在3.2 mg / L组中，从第7天起就非常明确（图2E）。铜的主要积累器官是肝脏，因此在本研究中，铜对鳃和肾组织没有明显的影响。
图2 暴露7、14和28天鳃的组织病理学变化：A）对照组：正常组织外观，显示清晰的初级板层（PL）、次级板层（SL）和层间层（IL）；B）0.05 mg/L：血管受损（DBV）、板层融合（LF）和初级板层隆起（UPL）；C）0.2 mg/L：充血（CN），隆起原发性板层（UPL）、原发性板层崩解（DPL）、层间层（IL）变薄（箭头）；D）0.8 mg/L：次级板层缩短（SSL）、板层崩解（LD）、广泛组织损伤，表现为板层变薄、完全板层破裂（LR）和IL（箭头）变薄；E） 3.2mg/L：次级板层缩短（SSL）、层间层（IL）变薄（箭头）、初级板层隆起（UPL）、IL破裂（ILR）。
肾脏是最早受到污染物影响的器官之一，在消除有害物质方面非常重要。HMs暴露后，肾脏结构被破坏，表现为肾小球坏死（GN）、肾小管间隙扩张、肾小管充血、肾小管变性和鲍曼囊扩张。尽管0.05 mg/L和0.2 mg/L组的肾小球坏死（GN）并不明显，但0.8 mg/L和3.2 mg/L组显示出显著变化（图3），这些变化，包括鲍曼氏囊变性，肾小球肾炎，肾小管管腔减少。0.05 mg/L组在第28天的损伤更为突出（图3B）；0.2 mg/L组在暴露14天时损伤更为明显（图3C）；0.8mg/L组损伤强度在第28天最高，在第7天和第14天稍低（图3D）；在3.2 mg / L组中，从第7天起破坏就很强烈（图3E）。 这表明HMs可以破坏组织结构，并且随着HMs浓度的增加，破坏作用增加，因此，组织病理学变化可以指示环境污染。
图3 暴露第7、14和28天肾脏的组织病理学变化：A）对照组：正常组织外观，显示明确的肾小球（G）、初级小管（PT）、远端小管（DT）和小管间隙（TS=椭圆形）；B）0.05 mg/L：肾小球（G），TS直径减小（#），TS扩张（*）；C） 0.2 mg/L：肾小管充血（CT）、肾小球（GN）、TS直径减小（#）、变性小管（箭头），以及TS扩张（*）；D）0.8 mg/L：肾小球坏死（GN），TS直径减小（#），退行性小管（箭头），小管间隙扩张（*），鲍曼囊扩张（+）；E）3.2 mg/L：肾小球坏死（GN），TS直径减小（#），变性小管（箭头），小管间隙扩张（*），鲍曼囊扩张（+）。
重金属混合物对抗氧化胁迫的影响
与对照组相比，暴露组的活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）显著增加，而总蛋白（TP）降低（图4）。肾脏中的ROS生成比鳃更普遍，从暴露的第7天到第14天增加，但在第28天减少（图4A）。HMs通过取代原始金属离子结合蛋白质基团的能力，导致酶失活和产生ROS（超氧自由基、羟基自由基和过氧化氢），这可能导致膜脂过氧化、基因组突变、酶活性降低、蛋白质降解和氨基酸氧化。在第7天和第14天，SOD生成量没有显著增加，但在第28天增加（图4B）。超氧化物歧化酶（SOD）有助于将过氧化氢转化为氧气和水，从而防止ROS积聚，ROS的减少和SOD水平的增加（图4）表明鱼类清除ROS和减少氧化损伤水平的能力更强。在所有暴露组中，丙二醛（MDA水平以时间和剂量依赖的方式增加（图4C）。丙二醛（MDA）是脂质过氧化物（LPO）的一个指标，反映自由基损伤的程度。HMs可对细胞膜产生负面影响，从而通过LPO刺激改变生理学，ROS的形成使细胞MDA水平波动，MDA浓度增加与活性氧浓度下降相关。蛋白质是鱼类必需的能量来源，当受到压力时，鱼类可能通过氨基酸氧化利用更多的蛋白质，总蛋白（TP）与MDA呈相反趋势（图4D）。在压力下，由于食物摄入减少、组织修复、体内平衡和解毒机制减少，蛋白质水平可能会降低。随着暴露时间和HMs浓度的增加，TP的减少与先前的研究类似。因此，高浓度的HMs会导致自由基的形成，从而增加损伤强度。
图4 暴露7、14和28天后鳃和肾脏的氧化应激变化：A）活性氧（ROS）；B）超氧化物歧化酶（SOD）；C）丙二醛（MDA）；D）总蛋白（TP）。
肠道微生物群落组成的变化
肠道微生物群在维持生物体的健康、生长和发育中起着至关重要的作用，这些微生物群可能会受到各种环境因素的不平衡，因此在毒理学研究中很重要。在本研究中，对照组中门的相对丰度没有显著变化，但0.8 mg/L和3.2 mg/L组从第7天到第28天出现了极端变化（图5A）。在第7天，0.8mg/L组以Fusobacteria（76.24%）为主，其次是Proteobacteria (12.38%)，Firmicutes(8.5%)， Bacteroidetes (1.59%)；在3.2mg/L组中，Proteobacteria百分比最高（82.45%），其次是Fusobacteria (8.61%)，Firmicutes (3.54%)，Bacteroidetes (3%)。在第14天，0.8mg/L组Proteobacteria（59.4%）增加，Fusobacteria（31.25%）减少，Firmicutes (6.99%) 和Bacteroidetes (2.07%)无明显变化；3.2mg/L组除Firmicutes（99.16%）外，上述菌门均消失。在第28天，0.8 mg/L组的特征菌是Proteobacteria（49.94%）、Actinobacteria (40.95%)和Firmicutes (3.76%)，但Fusobacteria和Bacteroidetes消失（图5A）。
暴露组的Firmicutes/Bacteroidetes比率受到干扰，这与先前的鲤鱼暴露于Cu的研究结果一致。在第14天（3.2mg/L组），Firmicutes占大多数，因为肠道菌群丰度非常低（图S2a），这一观察结果可能表明，在极端Cr浓度下，Firmicutes是最具抗药性的类群，但其它类群的耐受性有限。研究表明Firmicutes是一种碳水化合物发酵群，产生丁酸盐，主要为上皮细胞和胃肠道细胞提供营养和能量，提高粘液产量，起到抗癌和抗炎作用，其耗尽可能会损害肠道屏障的完整性，因此，高比例的Firmicutes（图5A）可能表明鱼类需要通过保持肠道屏障功能来维持健康，而Bacteroidetes与营养吸收、上皮细胞成熟和维持有关。有研究表明在低Cu浓度（高达0.28 mg/L）下，发现鲤鱼体内主要存在Proteobacteria、Fusobacteria、Verrucomicrobia、Bacteroidetes，而尼罗罗非鱼（1 mg/L Cd）中，分别在暴露8周和4周后，Bacteroidetes 和Proteobacteria占优势，这表明，在本研究中发现的肠道微生物群变化主要是由铬（Cr）引起的，因为铬主要被鱼吸收（图1）。在第28天，0.8 mg/L组出现Actinobacteria（图5A），Actinobacteria可以产生对病原微生物有活性的次级代谢产物，它的出现可能表明该组中的鱼易感染病原微生物。
在属水平上，在对照组和0.8 mg/L（第7天和第14天）组中主要检测到Cetobacterium，而在第14天3.2 mg/L组中，Lactococcus和Enterococcus普遍存在（图5B）。Enterococcus和Lactococcus与Cr无显著相关性，但与Cd、Cu呈正相关。相反，Bacteroides、Chitinibacter、Luteolibacter与Cr、Cd和Cu呈负相关（图S3），表明它们在所有暴露组中消失（图5B）。研究表明Cetobacterium和Lactococcus分别参与维生素B12的合成和葡萄糖发酵；Lactococcus在温水（>20°C）和冷水（4-10°C）中可占优势，而Bacteroides可在肠道内出现每日波动；Lactococcus产生细胞外产物，如乳酸、过氧化氢、二氧化碳、抗生素肽/蛋白质和有机酸，以抵御潜在病原体。因此，上述数据表明，重金属暴露导致肠道微生物失调，然而，益生菌可以通过肠道定植稳定肠道微生物群来防止失调，潜在的益生菌，如Bacillus sp.和Enterococcus sp.，可显著提高鱼类的饲料利用率或转化率、生长性能、免疫力、消化酶和抗氧化酶活性，以及抗病性。
图5 对照组、0.8 mg/L和3.2 mg/L组在7、14和28天，重金属暴露对肠道菌群的影响：a）在门水平鉴定的肠道微生物群的相对丰度；b）显示属水平的细菌热图。
在第7天，所有组共有70个OTU，而在第14天和第28天，所有组中分别共有72个和96个OTU（图6A、B、C）。
图6 维恩图显示了对照组、0.8 mg/L和3.2 mg/L组在7天（A）、14天（B）和28天（C）的特异和共有的OTUs。
目前的研究表明，重金属（HMs）对鱼类是有毒的，铬（Cr）是其中毒性最大的。鱼体内高铬的积累使其不适合人类食用。低浓度暴露会改变鱼类的生物学参数，但长期高浓度暴露会导致死亡。重金属吸收随重金属浓度的增加而增加。损伤程度随着时间和重金属剂量的增加而增加，引起极端的组织损伤、ROS生成和肠道微生物失调。高浓度重金属混合物（0.8 mg/L和3.2 mg/L）对组织和肠道有害。3.2mg/L的混合液引起最大限度的ROS生成和肠道微生物失调。需要进一步研究重金属混合物对鱼类的影响，特别是肠道微生物的变化。未来的研究可以揭示重金属在鱼类中的毒性机制。
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