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南京农业大学食品科学技术学院曾晓雄教授课题组的研究成果近期发表在SCI一区期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上，研究成果发现三种双歧杆菌的共生关系导致双歧杆菌在含有唾液酸化免疫球蛋白G的人类肠道菌群体外发酵中数量增加。在这项研究中使用了天昊生物创新型的微生物16S扩增子绝对定量测序技术对特定菌种的细胞数目进行了检测。在恭喜客户发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：Commensal Relationship of Three Bifidobacterial Species Leads to Increase of Bifidobacterium in Vitro Fermentation of Sialylated Immunoglobulin G by Human Gut Microbiota
中文题目：三种双歧杆菌的共生关系导致双歧杆菌在含有唾液酸化免疫球蛋白G的人类肠道菌群体外发酵中数量增加
期刊名：Journal of Agricultural and Food Chemistry（SCI一区期刊）
影响因子：4.192
唾液酸化免疫球蛋白G（IgG）是母乳中一种重要的免疫球蛋白，但由于胃蛋白酶的消化作用，其对成人肠道菌群的影响尚不清楚。本研究在前人IgG研究的基础上，采用体外厌氧发酵法研究了唾液酸化IgG对肠道菌群的影响，结果表明，添加唾液酸化IgG能显著促进双歧杆菌的生长。同时，三种双歧杆菌种, B. bifidum CCX 19061、Bembidion breve CCX 19041、B. longum subsp. infantis CCX 19042被分离出。此外，B. breve CCX 19041和B. longum subsp. infantis CCX 19042与B. bifidum CCX 19061在唾液酸化IgG培养基中表现出共培养生长特性，游离单糖和N-聚糖结构的变化也支持了这一特性。这些结果表明，双歧杆菌体外发酵的增加是由于三种双歧杆菌利用唾液酸化IgG释放的糖而形成了共生关系。
免疫球蛋白G（IgG）是一种具有抗体活性的糖蛋白，具有结合病原微生物、激活补体系统、介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性等功能，是主要的生物活性抗体之一，内源性IgG不仅参与免疫调节，而且外源性IgG对机体有有益的作用。例如，据报道，母乳中的IgG在帮助新生儿在生命早期建立免疫稳态方面起着重要作用。然而，当成人胃液中的胃蛋白酶作用时，完整的IgG可被酶消化成pFc′和F（ab′）2片段，这些片段只与抗原结合，没有其它免疫功能。为了使口服IgG在成人体内充分发挥其生物学功能，研制了一种在胃内保护IgG并在小肠释放IgG的逐层微胶囊。尽管有研究表明N-连接聚糖的唾液酸化可以直接将IgG从炎症抗体转化为抗炎介质，但其对肠道菌群的影响却被忽视。
肠道微生物群在人类健康中起着重要作用，可以通过饮食来调节。一些不易消化的食物成分可以促进肠道微生物群的生长。例如，母乳低聚糖（HMOs）作为碳源可以促进双歧杆菌的增殖。乳清蛋白产生的支链氨基酸可以提高阿克曼氏菌和双歧杆菌的丰度。另一方面，膳食成分还可以选择性地影响细菌的代谢途径，从而抑制某些细菌的生长。母乳低聚糖（HMOs）能抑制无乳链球菌的生长，IgA能竞争性地结合在致病菌表面，达到对有害细菌的抑制作用。因此，假设完整的唾液酸化IgG作为一种含N-聚糖的免疫性乳清蛋白，在与肠道菌群相互作用时，不仅能促进特殊细菌的生长，而且能以其抗体活性抑制病原菌的生长。虽然目前尚无关于唾液酸化IgG对肠道微生物群影响的报道，但间接证据表明，含唾液酸的膳食成分对肠道微生物群有重要影响。例如，唾液酸化母乳低聚糖（HMOs）可改善营养不良的生菌小鼠肠道微生物群的生长，而从鲫鱼卵中分离到的唾液酸化甘油蛋白则通过增加乳酸杆菌的相对丰度来防止骨质丢失。此外，研究表明只有某些肠道菌株能够代谢含有唾液酸的膳食成分。带有唾液酸酶的粘蛋白降解菌，Akkermansia muciniphila，可以从粘蛋白中释放出唾液酸。双歧杆菌还可以通过胞外唾液酸酶从低聚糖中释放唾液酸，短双歧杆菌可以将其作为碳源转运到细胞内唾液酸酶。此外，据报道，不能利用复合唾液酸聚糖的肠道细菌可以与其他肠道微生物释放的唾液酸交叉喂养。
母乳中的免疫球蛋白包含约700μg/ mL的总IgA，约150μg/ mL的总IgM和约20μg/ mL的IgG。IgG的N-连接聚糖有3种常见类型，包括高甘露糖型、杂交型和复合型。尽管尚未对母乳中IgG N-聚糖的结构进行研究，但一些研究表明，分娩后母亲血清IgG中高甘露糖型结构的含量仅为0.2％，而唾液酸化IgG的含量高达12.3％。当N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）与N-聚糖末端α-2,6连接时，IgG具有抗炎作用。唾液酸化IgG的N-连接聚糖是由一个含有N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）和经岩藻糖（Fuc）修饰的甘露糖（Man）组成的恒定的双十分位七糖核，将GlcNAc、半乳糖（Gal）和末端Neu5Ac分开。N-糖基化结构可用超高效液相色谱-质谱（uhpc-MS）分析。此外，具有类似聚糖结构的唾液酸化粘蛋白或母乳低聚糖（HMOs）可以用糖苷酶释放的成分喂养或交叉喂养肠道微生物群中的双歧杆菌。因此，结合寡糖或粘蛋白的水解和利用，研究唾液酸化IgG是如何被双歧杆菌代谢的是可行的。然而，一些研究主要集中在代谢机制上，包括分泌糖基水解酶、代谢途径以及已知外源微生物的相关基因簇。目前关于还没有人研究饮食成分与显著影响的肠道微生物群之间的相互作用。因此，本研究旨在通过体外人肠道菌群厌氧发酵模型来研究唾液酸化IgG对肠道菌群结构的影响，并鉴定肠道菌群中对唾液酸IgG有反应的双歧杆菌。此外，还研究了唾液酸化IgG的生长特性、游离单糖释放量和N-糖苷结构的变化，以阐明唾液酸化IgG对肠道菌群的影响机制。本研究为牛奶中免疫球蛋白生物活性的评价和应用开辟了一条新的途径和理论指导。
材料：
人IgG（>97%，摩尔重量150 kDa）；单糖标准品包括Neu5Ac、Gal、GlcNAc、Fuc和Man；3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮（PMP）；以及1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基苯二盐酸盐（DMB）从Sigma Chemical Co.购买。
唾液酸化IgG和非唾液酸化IgG的制备：
本文根据文献报道的制备方法，对唾液酸化IgG和非唾液酸化IgG进行了改进。
唾液酸化IgG和非唾液酸化IgG的体外发酵：
唾液酸化IgG和非唾液酸化IgG的体外发酵按报道的方法进行，并作了一些小的修改。新鲜人类粪便样本取自5名健康成年志愿者（3名男性和2名女性）。这些志愿者符合以下要求：不患任何肠道疾病，至少3个月内未服用任何益生菌或抗生素。为了使实验前的粪便稳定化，从收集粪便到厌氧箱培养，所有操作都要求在室温下20分钟内完成。将每个志愿者等量的粪便与高压灭菌的改良生理盐水溶液（cysteine-HCl 0.5 g/L, NaCl 9.0 g/L）混合，制备粪便悬浮液（10%，w/v）。去除食物残渣后，立即将上清液放在厌氧罐中使用。在Anaero Pack系统中，在9.0 mL的基础营养培养基和1.0 mL的粪便悬浮液中于37°C发酵24小时。 每个实验重复三次。
肠道菌群分析：
原始粪便没有发酵组（OR组）；体外发酵24小时，添加葡萄糖作为唯一的碳源组（G组）；体外发酵24 h，添加唾液酸化的IgG作为唯一的碳源组（SG组）；体外发酵24 h，添加非唾液酸化的IgG作为唯一碳源组（IG组）；上述四组作为研究对象，碳源浓度为5.0mg/mL，然后在上海天昊生物科技有限公司进行16S rRNA扩增子测序（V4）。
双歧杆菌的分离与鉴定：
根据前人的报道，经过一些改进，以改良的deMan Rogosa Sharpe (mMRS)琼脂为培养基，加入X-Gal，从体外发酵液中分离出双歧杆菌。将菌株在37°C下在Anaero Pack厌氧系统中培养48小时，然后移入有氧大气中进行6小时的比色反应。使用商业DNA提取试剂盒提取所有筛选出的蓝色分离物的DNA。用NCBI-GenBank对分离到的每个细菌进行16S rDNA扩增，并对最终序列进行同源性分析。在比较基因组分析的基础上，利用MEGA-X和FigTree 1.4.4软件构建了系统发育树。
多糖的质谱分析：
发酵24小时后，在补充了0.5％唾液酸化IgG的mMRS中，由双歧杆菌B. bifidum CCX 19061改变的N-聚糖的分析通过UHPLC-MS进行。
评估唾液酸化IgG对双歧杆菌生长的影响：
在含有0.001%（w/v）双歧杆菌、0.05%（w/v）L-半胱氨酸-HCl和0.5%（w/v）唾液酸IgG作为唯一碳源的mMRS培养基中进行培养。个体培养采用菌落计数法，在一个平板上选择30-300个CFU的活的稀释液计数。在添加1%（w/v）乳糖的mMRS琼脂培养基中，每6h测定一次细菌计数，持续48h。另一方面，采用上海天昊生物科技有限公司的16S扩增子绝对定量测序（V3-V4）评估了以唾液酸IgG为唯一碳源的双歧杆菌B. bifidum CCX 19061与Bembidion breve CCX 19041或B. longum subsp. infantis CCX 19042共培养过程（每6小时取一次样品，持续48小时）中微生物群落的变化。
IgG和单糖含量的测定：
采用高效液相色谱法（Agilent 1100），每12小时测定一次IgG和单糖(Man, Neu5Ac,Gal, Fuc)的含量，持续48小时。IgG的含量也通过商业ELISA检测试剂盒按照制造商的说明进行验证。
唾液酸化IgG对肠道菌群的影响
肠道微生物群在人类的健康和疾病中扮演着重要的角色，它可以通过饮食来调节。同时，糖蛋白被认为是细菌生长所需营养的碳源。因此，在我们之前关于将完整的IgG输送到成人肠道的研究基础上，通过体外发酵研究了唾液酸化IgG对肠道菌群的影响。结果表明，每个样本（4组，每组3个重复）的OTUs经过过滤和聚类，相似度为97%。如图S2所示，所有样本的稀疏曲线和香农曲线均达到稳定状态，说明大部分系统类型都被覆盖，测序数据确实可靠。此外，采用主成分分析法（PCA）分析了不同样品肠道菌群组成的差异。如图1a所示，每一组都与其他组有显著差异，这表明微生物群的处理在统计学上存在显著差异。此外，基于Bray−Curtis方法（图1b）的聚类分析结果表明，OR、G、SG和IG组发生了明显的分离，这与PCA的结果一致。
某些细菌具有去糖基化糖蛋白和利用聚糖作为碳源的能力。因此，对唾液酸化IgG衍生聚糖形成的肠道菌群组成进行了研究。对于组间丰度的差异，如图2a所示，与OR、G、IG组相比，SG组放线菌（包括双歧杆菌和柯林斯菌）和厚壁菌（包括厌氧菌）在SG组中占绝对优势。与OR、G和SG组相比，IG组的厚壁菌（包括链球菌和乳酸菌）水平较高。此外，由于某些类群相对丰度的差异，图S3和2b（相对丰度超过0.5%）分别显示了肠道微生物群落在门和属水平上的分布情况。所有处理样品的肠道菌群主要由拟杆菌属、双歧杆菌属、大肠杆菌属、粪杆菌属、大肠杆菌属/志贺氏菌属、巨球菌属和乳杆菌属组成。如图2c所示，对于益生菌（双歧杆菌和乳酸杆菌）的相对丰度，值得注意的是，添加唾液酸化IgG（SG组）导致双歧杆菌的最大增加量，而添加非唾液酸化IgG（IG组）导致乳酸杆菌的增加量最大。与G组相比，SG组和IG组的大肠杆菌/志贺氏菌相对丰度显著降低，可能是由于IgG通过与病原菌结合而具有抗菌活性。
唾液酸化IgG富集的双歧杆菌的分离
双歧杆菌是母乳喂养婴儿肠道微生物中的一种，以其安全性和健康效益而闻名。基于上述结果，添加唾液酸化IgG作为体外发酵的唯一碳源，双歧杆菌得到了显著的富集。因此，本研究试图分离出优势双歧杆菌菌株，首先，通过X-Gal释放吲哚的比色反应，分离出mMRS上的深蓝色菌落。因此，革兰氏染色和显微镜检查的革兰氏阴性菌被过滤掉。此外，结合筛选出与双歧杆菌颜色、大小和形状一致的菌株(CCX 19061, CCX 19041, CCX 19042)。为进一步鉴定分离菌株，采用16S rDNA扩增和测序，如图S5所示，所识别的三个双歧杆菌菌株分别表示为B. bifidum CCX 19061, B. breve CCX 19041, B. longum subsp. infantis CCX 19042。有趣的是，这三种分离的双歧杆菌是母乳喂养婴儿肠道中常见的双歧杆菌，尽管在本研究中，新鲜成人粪便样本用于体外发酵。
分离双歧杆菌在唾液酸IgG上的生长
为了研究分离的双歧杆菌是否能够利用唾液酸化IgG的聚糖作为碳源，用活菌计数法分别对添加0.5%（w/v）唾液酸IgG的mMRS培养基上的双歧杆菌B. bifidum CCX 19061, B. breve CCX 19041, B. longum subsp. infantis CCX的生长分别进行了48h的观察。如图3所示，B. breve CCX 19041和B. longum subsp. infantis CCX 19042在含唾液酸IgG的mMRS培养基中都没有生长。12h后，两种双歧杆菌的数量从103cfu/mL下降到几乎<1cfu/mL，说明唾液酸化IgG的聚糖不能作为碳源。然而，观察到B. bifidum CCX 19061的数量在培养30小时后从10 3 cfu/mL增加到近10 8 cfu/mL，随后在48 h时略有下降，约为10 6 cfu/mL。有趣的是，尽管B. breve CCX 19041和B. longum subsp. infantis CCX 19042不能以唾液酸化IgG为唯一碳源生长，仍从体外发酵中分离得到，因此，可以假设B. breve CCX 19041和B. longum subsp. infantis CCX 19042与双歧杆菌B. bifidum CCX 19061在唾液酸化IgG培养基中共培养时可以交叉喂养。
为了进一步验证三种双歧杆菌之间的交叉喂养，我们采用16S扩增子绝对定量测序技术评估了在唾液酸化IgG培养基中B. bifidum CCX 19061分别与Bembidion breve CCX 19041或B. longum subsp. infantis CCX 19042共培养时的生长情况。如图4a所示，与B. bifidum CCX 19061共培养后，B.breve CCX 19041显示生长得到改善，在24小时达到细胞数107个/mL（48小时略有下降）。同样的情况也观察到了B. longum subsp. infantis CCX 19042在和B. bifidum CCX 19061共培养中达到108细胞/ mL（图4b）。结果表明，这两种双歧杆菌物种可以交叉喂养B. bifidum CCX 19061释放的唾液酸化IgG多糖。与B. longum subsp. infantis CCX 19042共培养时相比，B. bifidum CCX 19061的细胞数与B. breve CCX 19041共培养时相对较低，这可能归因于竞争有限量的唾液酸化IgG衍生的多糖或由产酸菌株的共培养引起的较低pH。
双歧杆菌对唾液酸化IgG的变化影响
双歧杆菌的存活和生长与代谢来自多种多聚、寡糖和糖蛋白的复杂碳水化合物的能力有关。因此，在培养48h的过程中，每隔12h测定释放的单糖的含量，以考察双歧杆菌对唾液酸化IgG的变化影响。如表1所示，在未发酵的含菌株的唾液酸化IgG培养基中未检测到单糖，说明唾液酸化IgG是培养基中唯一的碳源。随着B. bifidum CCX 19061的个体生长，单糖含量显著改变，游离Neu5Ac的含量从12h时的4.10nmol/mL增加到48h时的24.80nmol/mL，这与先前报道的双歧杆菌缺乏唾液酸利用簇的基因组一致。相反，游离Gal的量从12h时的3.56nmol/mL下降到48h时的0（未检测到），这表明B. bifidum CCX 19061吸收了Gal作为碳源。有趣的是，对于B. breve CCX 19041 和B. longum subsp. infantis CCX 19042的个体生长，未检测到单糖，这为这两个菌株在含唾液酸IgG的mMRS培养基中没有个体生长提供了合理的解释。
进一步研究唾液酸化IgG释放的单糖在共培养过程中对B. breve CCX 19041或 B. longum subsp. infantis CCX 19042的生长和生存能力的影响（表1）。结果表明，在B. bifidum CCX 19061与B. breve CCX 19041共培养后，Neu5Ac的含量从共培养12h的1.32 nmol/mL下降到共培养36小时后的未检测到，这与短双歧杆菌含有唾液酸吸收和代谢的基因簇的报道一致。此外，还观察到一种现象，即共培养中的游离Gal含量低于B. bifidum CCX 19061单菌培养释放的游离Gal，这可能是B. breve CCX 19041和B. bifidum CCX 19061之间竞争使用的结果。另一方面，在B. bifidum CCX 19061与B. longum subsp. infantis CCX 19042共培养48h后，释放的Neu5Ac量几乎相当于B. bifidum CCX 19061单菌培养释放的Neu5Ac量，说明B. longum subsp. infantis CCX 19042和B. bifidum CCX 19061都不能利用释放的游离Neu5Ac。此外，在B. bifidum CCX 19061与B. longum subsp. infantis CCX 19042共培养中游离Gal的含量低于B. bifidum CCX 19061与B.breve CCX 19041共培养中游离Gal的含量，表明Gal在B. longum subsp. infantis CCX 19042 和B. bifidum CCX 19061共培养过程中得到竞争性利用。另外，在个体和共培养发酵中都不存在游离的Man，GlcNAc和Fuc，这说明三种分离的双歧杆菌不能从唾液酸化的IgG中释放和利用这些单糖。
为了进一步验证双歧杆菌B. bifidum CCX 19061发酵前后N-糖苷结构的变化，用LC-MS分析唾液酸化IgG的N-聚糖（MS和总离子电流色谱图如图S7-S9所示）。如图5a所示，发酵后除了23.87min峰的结构被末端Neu5Ac部分修饰，其他峰的N-聚糖结构最终只被GlcNAc或Gal修饰。相反，发酵前的所有N-聚糖结构都被末端Neu5Ac部分修饰（图5b），表明制备的唾液酸化IgG纯度高。
此外，还发现发酵24小时后，唾液酸化N-聚糖的相对丰度从100下降到2.64%（表2），表明B. bifidum CCX 19061可以释放末端唾液酸（剩余的2.64%唾液酸聚糖可能是由于发酵时间短）。此外，N-聚糖的Gal含量也发生了显著变化，发酵前，唾液酸化IgG的N-聚糖中，两个Gal修饰的结构>68.06%，一个Gal修饰的结构<31.94%。但发酵后结构发生了较大的变化，两个Gal占35.49%，一个Gal占42.39%，不含Gal占21.86%，这些结果也支持了B. bifidum CCX 19061水解利用Gal的单糖结果。
综上所述，在人肠道菌群体外发酵过程中添加唾液酸化IgG显著促进双歧杆菌的生长。同时，三种常见于母乳喂养婴儿肠道中的双歧杆菌B. bifidum CCX 19061、Bembidion breve CCX 19041、B. longum subsp. infantis CCX 19042，被富集并分离。此外，Bembidion breve CCX 19041和B. longum subsp. infantis CCX 19042可能会受益于双歧杆菌B. bifidum CCX 19061胞外糖苷酶在唾液酸化IgG培养基中释放的碳水化合物，这个结论得到共培养的生长特性，游离单糖和N-聚糖结构的变化支持。所有这些结果表明，体外发酵中双歧杆菌数量的增加是由于三种双歧杆菌利用唾液酸化IgG释放的糖类而形成共生关系的结果。
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